t-PA負向調控p75NRT改變血管外膜自主神經重構參與動脈粥樣硬化*

張勁松,杜榮增,王中群,李光宇,張新茹,張梓桑

(江蘇大學附屬江濱醫院心內科， 江蘇鎮江 212001)

論著·基礎研究

t-PA負向調控p75NRT改變血管外膜自主神經重構參與動脈粥樣硬化*

張勁松,杜榮增△,王中群,李光宇,張新茹,張梓桑

(江蘇大學附屬江濱醫院心內科， 江蘇鎮江 212001)

目的研究組織型纖溶酶原激活物(t-PA)對p75NTR、炎性反應、免疫調節、氧化應激的作用，以及對內膜增生的影響。方法對糖尿病兔給予頸動脈外膜剝除建立動物模型，然后進行血管損傷處理，同時給予t-PA控釋微球后，免疫熒光染色分別觀察對照組和處理組神經重構的變化情況，同時檢測給予t-PA控釋微球對乙酰膽堿和去甲腎上腺素釋放的影響。RT-PCR檢測t-PA釋控微球對局部血管組織的炎癥、免疫反應和氧化應激的影響。采用交感神經元與平滑肌細胞共培養，之后給予乙二醛進行處理作為動脈粥樣硬化細胞模型，以t-PA處理組作為干預組，觀察t-PA對膽堿能神經元數目，與平滑肌細胞之間的突觸連接數目、乙酰膽堿分泌的影響。RT-PCR檢測t-PA-MMP-p75NTR-NF-κB信號通路的改變。結果給予t-PA控釋微球能明顯增加膽堿能神經元數目和神經纖維(P<0.05)而不影響去甲腎上腺素能神經元數目和神經纖維(P>0.05)，并且導致乙酰膽堿釋放增多(P<0.05)，最終抑制內膜增生(P<0.05)。離體交感神經元與平滑肌細胞共培養，之后給予乙二醛處理作為動脈粥樣硬化細胞模型中t-PA促進膽堿能神經元增殖、增加乙酰膽堿的分泌和促進膽堿能神經纖維的數目增多(P<0.05)。RT-PCR檢測發現t-PA能夠激活MMPs，抑制p75NTR-NF-κB信號通路(P<0.05)。結論t-PA激活MMPs反饋抑制p75NTR-NF-κB信號通路增加血管外膜自主神經重構延緩動脈粥樣硬化疾病的發生發展。

自主神經重構;纖溶酶原激活劑;p75NTR;動脈粥樣硬化;血管外膜

血管外膜自主神經重構障礙可導致血管的結構、功能及機體的炎性反應和代謝狀態紊亂，參與動脈粥樣硬化疾病的發生發展[1-3]。血管外膜自主神經主要由分布在動脈內膜/外膜交界區域的膽堿能神經纖維，和位于動脈外膜區域的去甲腎上腺素能神經纖維構成[4-5]。組織型纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,t-PA)是除了尿激酶以外主要已知的可有效降解動脈壁細胞外基質的神經系統產物。p75NTR作為神經元的負向調控受體即凋亡相關受體，其對中樞膽堿能神經元具有選擇性抑制作用，基因敲除p75NTR可增加中樞神經系統的膽堿能神經元數目、調節細胞大小并抑制細胞的凋亡，其表現類似神經重構，但在外周神經中是否同樣存在類似作用還缺乏研究。在乳腺轉移腫瘤細胞中，p75NTR負向調節基質金屬蛋白酶(MMPs)和組織金屬蛋白酶抑制劑11(TIMP11)，這一調控通路提示神經營養因子系統與血管外膜的局部纖溶系統可能存在某種相關性，如t-PA可能通過激活MMP反饋抑制p75NTR，隨后有下游的核因子κB(NF-κB)和JNK介導信號傳導，進而影響神經細胞軸突的延伸及外周神經的神經重構等，有必要進行深入研究。本實驗主要研究t-PA通過激活MMP反饋抑制p75NTR，促進局部膽堿能神經纖維再生，抑制局部血管神經重構，使局部血管的交感/副交感神經比例傾向于副交感，使過多的膽堿能神經纖維末梢釋放的乙酰膽堿等物質發揮抗炎、免疫調節、抗氧化應激作用，最終抑制內膜增生。本實驗不但有利于進一步闡明動脈粥樣硬化新的調控機制，豐富動脈粥樣硬化發生發展的新理論，而且將會為研制消退動脈粥樣硬化斑塊的新型藥物打下基礎。

1 材料與方法

1.1主要材料 t-PA購自美國R&D公司；雌性新西蘭兔購自濟南金豐實驗動物有限公司；高糖、高脂飼料(10%豬油、37%白蔗糖混合53%基礎飼料)由揚州大學比較醫學中心提供;蘇木素購自中國醫藥集團上海化學試劑公司；伊紅購自上海試劑三廠；重組人神經生長因子(nerve growth factor,NGF)購自美國R&D公司;兔乙酰膽堿和去甲腎上腺素ELISA試劑盒購自上海瀘鼎生物科技有限公司；膽堿轉移酶和酪氨酸羥化酶一抗購自上海碩博生物有限公司； 反轉錄PCR(RT-PCR)試劑盒購自碧云天生物科技有限公司;引物由上海生工生物科技有限公司合成；熒光倒置光學顯微鏡(日本Olympus公司)；體視顯微鏡(中國江南儀器有限公司)；顯微手術器械(上海手術器械廠)；病理包埋機(中國派斯杰公司)；病理石蠟切片機(德國Leica公司)；-80 ℃低溫冰箱(日本Sanyo公司)；RT-PCR儀(美國ABI公司)。

1.2糖尿病兔頸動脈外膜剝除血管損傷模型的建立 60只6個月體質量均在3.5 kg左右的雌性新西蘭兔給予高糖、高脂飼料單籠喂養誘發糖尿病，通過代謝指標(血糖、血脂、糖化血紅蛋白等)篩選出成功建立模型的42只糖尿病兔。暴露兔的頸動脈，采用膠原酶結合物理方法剝除外膜制成血管損傷動物模型備用，在手術后放置t-PA控釋微球在剝離外膜血管與未剝離的交界處做為處理組，對照組在相同位置放入介質微球，在潔凈環境下繼續高脂喂養14 d后處死動物并取材。

1.3免疫熒光染色和蘇木精-伊紅(HE)染色 戊巴比妥鈉腹腔注射(50 mg/kg)麻醉后，4%多聚甲醛灌注新西蘭兔，在顯微鏡下分離血管放入4%多聚甲醛固定， 4 ℃保存。取下的標本石蠟包埋前測量動脈瘤的頸寬、瘤高。之后10%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋切片，HE染色和光鏡檢查。另一部分標本進行熒光染色，OTC包埋動脈樣品常規5 μm切片，切片脫蠟，水化，3%甲醇-過氧化氫孵育10 min，PBS 洗 10 min×3次，0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH為6.0)抗原修復98 ℃持續20 min，自然冷卻至室溫， PBS常規漂洗，用Triton-X100 BSA封閉37 ℃ 2 h，加一抗分別使用膽堿轉移酶(choline acetyltransferase,ChAT)抗體標記膽堿能神經纖維、絡氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗體標記去甲腎上腺素能神經纖維，4 ℃過夜，第2天PBS常規漂洗，熒光二抗37 ℃孵育2 h，PBS常規漂洗甘油封片。顯微鏡觀察拍照。HE染色圖片和免疫熒光圖片采用萊卡RX250/QWN進行圖像采集，內膜的增生以新生內膜與中膜的比例(I/M)評價新生內膜厚度。IPP軟件用于細胞數目的統計。

1.4交感神經元與平滑肌細胞共培養 平滑肌細胞和交感神經元的分離：取新西蘭兔血管組織,充分剪碎后用0.25%的胰酶消化的方法獲得單細胞懸液,在含有15%胎牛血清的DMEM培養液中差速貼壁1 h,取上清離心,以去除成纖維細胞。收集未貼壁細胞,其中主要為平滑肌細胞。找到交感神經干(兔子的迷走神經和交感神經是分開行走的，不像反芻動物在頸部是迷走神經、交感神經干向前行走的)，然后順交感干向前至顱底腹側，找到頸前神經節，用眼科剪準確地夾住頸前神經節的前端，取出頸前神經節，用注射器和小濾器過濾到一個15 mL無菌的離心管中，加上分離神經節組織。置培養箱中用0.25%的胰酶消化液消化18 min，然后加10 mL含10%胎牛血清的DMEM培養液于組織中作用1～2 min，終止消化。離心后，吸除上清中的細胞碎片，將沉淀用含5% FBS的DMEM重懸，然后將分離的新生兔平滑肌(濃度為1.0×106個mL)與分離的平滑肌細胞細胞(濃度為2×105個mL)混合,加入預先包被的12孔板中,加2 mL含胎牛血清的培養基,50 ng/mL NGF,5% CO2、37 ℃培養箱中,進行共培養，第2天換液1次[6-7]。

1.5ELISA檢測乙酰膽堿和去甲腎上腺素 根據乙酰膽堿和去甲腎上腺素ELISA試劑盒說明書，檢測剝離外膜段血管內膜的乙酰膽堿和去甲腎上腺素的水平。

1.6RT-PCR 分別隨機抽取8只處理組新西蘭兔，用Trizol沉淀法提取總 RNA,按照反轉錄試劑盒的操作步驟進行反轉錄反應。所得 cDNA用于后續NF-κB、MMP-2、MMP-9、p75NTR的實時熒光定量 PCR反應。將GAPDH作為內參基因。同時將 PCR產物進行測序以及做熔解曲線,以保證以上 PCR反應產物良好的特異性。計算△Ct值用來比較給藥前后mRNA的表達變化。每個PCR反應都設置3個復孔。引物序列如下，NF-κB正向引物：5′-GGT GCC TTT TGC GAG CAG TAT C-3′；反向引物：5′-CGT ATG GAC CAG AAT GTG ACG G-3′。MMP-2正向引物：5′-CTG GCT GTG CAA TAC CTG AA-3′；反向引物：5′-CAG GGT CCA TAG CTC ATC GT-3′。MMP-9正向引物：5′-ATC TTC CTG GGC AAG CAG TA-3′；反向引物：5′-CTG GCA CCG ATG AAT GAT CT-3′。p75NTR正向引物：5′-AGG CAC CAC CGA CAA CCT C-3′；反向引物：5′-CAC AAG GCC CAC AAC CAC A-3′。GAAPDH正向引物：5′-ACC ACC ATG GAG AAG GCT GG-3′；反向引物：5′-CTC AGT GTA GCC CAG GAT GC-3′。

2 結 果

2.1t-PA控釋微球后明顯增加膽堿能神經元數目而不影響去甲腎上腺素能神經元 糖尿病兔頸動脈外膜剝除血管損傷模型建立后給予t-PA控釋微球，筆者通過對臨近剝離外膜的一段仍完整的血管進行免疫熒光檢測膽堿能神經元數目和去甲腎上腺素能神經元。結果發現處理組膽堿能神經元的數目較對照組明顯增加(P<0.05)，但去甲腎上腺素能神經元未受影響(P>0.05),見圖1。

2.2t-PA控釋微球后明顯增加膽堿能神經纖維而不影響去甲腎上腺素能神經纖維 通過觀察剝除血管外膜段的單純內膜膽堿能神經纖維和外膜及內膜處去甲腎上腺素能神經纖維的變化情況，筆者發現與神經元數目結果一致，處理組膽堿能神經纖維較對照組明顯增加(P<0.05)；而去甲腎上腺素能神經纖維未受影響(P>0.05)，見圖2。

A：免疫熒光圖；B:熒光定量分析圖；a:P<0.05，與對照組比較

圖1 t-PA對動脈粥樣硬化模型兔交感神經中膽堿能神經元及去甲腎上腺素能神經元的影響

A:組織免疫熒光圖；B:熒光定量分析圖；a:P<0.05,對照組比較

圖2 t-PA控釋微球對膽堿能神經纖維及去甲

腎上腺素能神經纖維的影響

A:乙酰膽堿；B：去甲腎上腺素；a:P<0.05，與對照組比較

圖3兩組大鼠乙酰膽堿和去甲腎上腺素水平比較

2.3t-PA控釋微球后明顯增加膽堿能神經纖維末梢釋放的乙酰膽堿而不影響去甲腎上腺素水平不變 通過ELISA檢測剝除血管外膜段的單純內膜乙酰膽堿、去甲腎上腺素水平發現處理組膽堿能神經纖維末梢釋放的乙酰膽堿較對照組明顯增加(P<0.05)，去甲腎上腺素水平不變，見圖3。

A:HE染色圖；B:HE染色分析圖；a:P<0.05，與對照組比較

圖4 t-PA控釋微球對血管內膜的影響

2.4t-PA控釋微球后明顯降低血管內膜的增生 HE染色發現t-PA控釋微球明顯降低血管內膜的增生(P<0.05)，見圖4。

2.5離體t-PA促進膽堿能神經元突觸形成，增加乙酰膽堿的分泌和促進膽堿能神經纖維的數目 筆者通過VAChT染色檢測膽堿能神經元突觸形成、膽堿能神經纖維的數目發現，在離體細胞中t-PA促進膽堿能神經元突觸形成，增加乙酰膽堿的分泌和促進膽堿能神經纖維的數目增加(均P<0.05)，見圖5。

2.6t-PA能夠激活MMPs反饋抑制p75NTR-NF-κB信號通路 為了進一步探討t-PA影響膽堿能神經元的機制，筆者用RT-PCR檢測MMP-2，MMP-9，p75NTR和NF-κB的表達的情況。發現在離體培養的交感神經元中t-PA能夠增加MMP-2和MMP-9的表達，抑制p75NTR的表達(均P<0.05)，抑制NF-κB的表達見圖6。

A:膽堿能神經元突觸；B:乙醇膽堿；C：膽堿能神經纖維；a：P<0.05，與對照組比較

圖5兩組大鼠膽堿能神經元突觸、乙醇膽堿、膽堿能神經纖維比較

A：MMP-2；B:MMP-9；C：p75NTR；D:NF-κB；a：P<0.05，與對照組比較

圖6兩組大鼠MMP-2、MMP-9、p75NTR、NF-κB水平比較

3 討 論

血管外膜自主神經重構障礙可導致血管的結構、功能及機體的炎性反應和代謝紊亂，參與動脈粥樣硬化疾病的發生發展[1-3]。目前的基礎研究表明，除血管內膜損傷可導致動脈粥樣硬化病變之外，外膜病變也可導致動脈粥樣硬化而且其起病時間還早于內膜病變。研究提示若早期對外膜實施一定的干預措施可能延緩或中止AS病變的進程，因此近年來動脈粥樣硬化疾病的基礎研究重點已由血管內膜和中層轉向外膜[8]。血管周圍分布有大量的神經纖維，這些神經纖維除了含有傳統的神經遞質去甲腎上腺素和乙酰膽堿之外，還含有神經營養因子(如BDNF、NGF、NT-3和CDNF等)及t-PA等。神經末梢中的t-PA與外膜其他細胞分泌的PAI-1構成局部纖溶系統，t-PA是除了尿激酶以外已知主要的可有效降解動脈壁細胞外基質的神經系統產物。在移植的靜脈血管周圍通過控釋給予t-PA(血管周圍放置微球，控釋t-PA)在細胞外基質產生趨化性梯度能夠引導血管平滑肌細胞從血管腔中遷移出來，Okdama等[9]的研究發現術后7 d t-PA處理組的血管平滑肌細胞大多分布于血管外周，其內膜/中層比值明顯降低，并抑制新生內膜的增生。但t-PA抑制新生內膜增生和防止術后再狹窄的作用，目前仍有爭論。Kodama等[10]通過反轉錄病毒載體將t-PA和一氧化氮合酶(eNOS)基因分別轉染平滑肌細胞，再將細胞種植至聚四氟乙烯編織的移植物中，隨后將血管移植物置入兔的主動脈內，在術后30 d和100 d后分別檢查移植物內的血栓形成和內膜增生情況，發現經過基因工程修飾的表達t-PA的血管平滑肌(SMC)盡管有助于抑制移植物腔內血栓的形成，但卻導致內膜顯著增生，而僅有在種植細胞內表達eNOS才可抑制新生內膜的增生。本研究發現給予t-PA控釋微球后明顯增加膽堿能神經纖維而不影響去甲腎上腺素能神經纖維，乙酰膽堿釋放增多，炎性反應被抑制，最終抑制內膜增生。離體交感神經元與平滑肌細胞共培養，之后給予乙二醛處理體外培養的交感神經元作為動脈粥樣硬化細胞模型中，t-PA促進膽堿能神經元增殖、增加乙酰膽堿的分泌和促進膽堿能神經纖維的數目，而不影響去甲腎上腺素能神經元。

神經營養因子家族中主要有BDNF、NGF、絡氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor,Trk)和p75NTR,在動脈粥樣硬化病變中BDNF和p75NTR高表達，而NGF低表達，且其表達程度與病變的嚴重程度顯著相關。 NGF、BDNF、正向調控的Trk及負向調控的p75NTR構成局部神經營養因子系統。p75NTR作為神經元的負向調控受體即凋亡相關受體，其對中樞膽堿能神經元具有選擇性抑制作用，基因敲除p75NTR可增加中樞神經系統的膽堿能神經元數目、細胞大小并抑制細胞的凋亡，其表現類似神經重構，但在外周神經中是否同樣存在還缺乏研究[11]。t-PA可能通過激活MMPs反饋抑制p75NTR，隨后有下游的NF-κB和JNK介導信號傳導， 在乳腺轉移腫瘤細胞中，p75NTR負向調節MMP和TIMP11，這一調控通路提示神經營養因子系統與血管外膜的局部纖溶系統可能存在某種相關性[12-13]。本研究結果表明t-PA能夠增加MMP-2和MMP-9的表達，抑制p75NTR的表達，抑制NF-κB的表達。綜上所述t-PA通過激活MMPs反饋抑制p57NTR，促進局部膽堿能神經纖維再生，抑制局部血管神經重構，使局部血管的交感/副交感神經比例傾向于副交感，使過多的膽堿能神經纖維末梢釋放的乙酰膽堿等物質發揮抗炎、免疫調節、抗氧化應激作用，最終抑制內膜增生，延緩動脈粥樣硬化疾病的發生發展。

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t-PAnegativelyregulatingp75NRTforinvolvinginatherosclerosisbychangingreconstructionofvascularoutermembraneautonomicnerve*

ZhangJingsong,DuRongzeng△，WangZhongqun,LiGuangyu,ZhangXinru,ZhangZisang

(DepartmentofCardiology,AffiliatedJiangbinHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212001,China)

ObjectiveTo study the effect of tissue plasminogen activator (t-PA) on p57NTR,inflammatory reaction,immune regulation and oxidative stress and its effect on intimal hyperplasia.MethodsThe vascular injury treatment was performed in the diabetic rabbit model with carotid arterial adventitia stripping,meanwhile t-PA controlled release microspheres were given,the nerve distribution in the local blood vessels was observed by immunohistochemical staining.The change of nerve remodeling in the control group and treatment group was observed,meanwhile the effect of giving t-PA controlled release microspheres on the release of acetylcholine and norepinephrine was detected.RT-PCR was used to detect local vascular tissue inflammation,immune effects and oxidative stress.The sympathetic neurons and smooth muscle cell co-culture was adopted,then giving glyoxal treatment as the atherosclerosis cell model.With the t-PA treatment group as the intervention group,the effect of t-PA on the number of cholinergic neuron,and synaptic connections between the smooth muscle cells and acetylcholine secretion was observed.The change of t-PA-MMP-p75NTR and NF-kappa B signaling pathway were detected by RT-PCR.ResultsThe vascular injury treatment was performed in the diabetic rabbit model with carotid arterial adventitia stripping,meanwhile t-PA controlled release microspheres were given,the nerve distribution in the local blood vessels was observed by immunohistochemical staining.The change of nerve remodeling in the control group and treatment group was observed,meanwhile the effect of giving t-PA controlled release microspheres on the release of acetylcholine and norepinephrine was detected.RT-PCR was used to detect local vascular tissue inflammation,immune effects and oxidative stress.The sympathetic neurons and smooth muscle cell co-culture was adopted,then giving glyoxal treatment as the atherosclerosis cell model.With the t-PA treatment group as the intervention group,the effect of t-PA on the number of cholinergic neuron,and synaptic connections between the smooth muscle cells and acetylcholine secretion was observed.The change of t-PA-MMP-p75NTR and NF-kappa B signaling pathway were detected by RT-PCR.Conclusiont-PA activates MMPs and feedback inhibits p75NTR-NF-kappa B signaling pathway to increase vascular adventitia autonomic nerve reconstruction and delay the occurrence and development of atherosclerosis disease.

] autonomic nerve reconstruction；plasminogen activators；p75NTR;atherosclerosis；vascular adventitia

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.006

2015年江蘇省鎮江市課題(SH2015036)。

張勁松(1976-)，碩士，主治醫師，主要從事動脈粥樣硬化研究。△

，E-mail:dubingchen001@foxmai1.com。

R541.4

A

1671-8348(2017)36-5055-04

2017-08-20

2017-09-28)