Wnt3a通過整合素連接激酶調節血管平滑肌細胞遷移和黏附*

吳校林,朱 銳,李 彬,劉文衛,周 青,趙玉勤

(湖北文理學院附屬襄陽市中心醫院心血管內科，湖北襄陽 441000)

論著·基礎研究

Wnt3a通過整合素連接激酶調節血管平滑肌細胞遷移和黏附*

吳校林,朱 銳△,李 彬,劉文衛,周 青,趙玉勤

(湖北文理學院附屬襄陽市中心醫院心血管內科，湖北襄陽 441000)

目的探討重組Wnt3a蛋白對大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)遷移和黏附的影響及相關機制。方法原代培養大鼠VSMCs，實驗分為Wnt3a組和對照組，通過Transwell實驗檢測VSMCs的遷移能力，細胞基質黏附實驗檢測VSMCs黏附細胞外基質的能力，Western blot檢測VSMCs中β-連環蛋白(β-catenin)、磷酸化β-catenin(Ser675)、糖原合成激酶3β(GSK-3β)，磷酸化GSK-3β(Ser9)、整合素連接激酶(ILK)的蛋白表達水平。結果Wnt3a組中VSMCs遷移的數量明顯高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，Wnt3a組中VSMCs黏附于膠原Ⅰ的數量和光密度值均顯著增加(P<0.05)，且Wnt3a組中磷酸化β-catenin(Ser675)、磷酸化GSK-3β(Ser9)和ILK蛋白的表達水平均顯著上調(P<0.05)。結論Wnt3a可以通過ILK調節VSMCs遷移和黏附。

Wnt蛋白質類；肌,平滑,血管；細胞運動；細胞黏附；蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶

Wnt蛋白通過分泌作用與位于細胞膜上的受體相結合，激活細胞內信號通路，調節靶基因的表達，控制細胞的生理行為和生物進程，包括細胞黏附、遷移、分化、增殖、極性與凋亡等[1]。Wnt信號傳導通路分為經典Wnt信號通路和非經典Wnt信號通路，其中經典Wnt信號通路，即Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)通路是Wnt信號中研究最清楚的一條通路，在整個進化過程中高度保守，Wnt3a可以激活經典Wnt信號通路。當經典Wnt信號通路活化時，Wnt與受體Fzd結合，引起β-catenin在細胞內累積，并進入細胞核與淋巴細胞增強因子、T細胞因子形成復合物，激活下游靶基因的轉錄[1-3]。β-catenin的活性也受到整合素連接激酶(integrin-linked kinase,ILK)的調節，ILK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以與胞質區的β1和β3整合素結合，控制細胞外基質與細胞骨架的連接，從而調節細胞遷移和黏附[4-5]。研究發現ILK磷酸化后可以促進β-catenin核易位并與淋巴細胞增強因子形成復合物[6]。本研究采用重組Wnt3a蛋白激活Wnt/β-catenin通路，觀察其對大鼠血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)遷移和黏附的影響并探討相關的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 Sprague-Dawley 雄性大鼠購自武漢大學動物實驗中心，體質量100～150 g，許可證號SCXK(鄂)2008-0004。重組Wnt3a蛋白購自美國R&D公司，抗β-catenin和磷酸化β-catenin(Ser675)抗體均購自美國Cell Signaling公司，抗糖原合酶激酶3β(GSK-3β)，磷酸化GSK-3β(Ser9)和α肌動蛋白(α-actin)抗體均購自美國Santa Cruz公司，膠原Ⅰ和抗ILK抗體購自美國Sigma公司，相關二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。DMEM培養液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國HyClone公司。Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2方法

1.2.1VSMCs原代培養 無菌條件下分離Sprague-Dawley大鼠胸主動脈，小心去除外膜和內膜，將中層平滑肌切成1 mm2左右的組織塊，用含20% FBS的DMEM培養液行組織塊貼壁法原代培養VSMCs；在37 ℃、5% CO2條件下靜置培養，3 d后更換培養液。待單層細胞覆蓋細胞培養皿約80%時，取出組織塊進行傳代。用0.25%胰蛋白酶消化細胞，含10% FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養液行傳代培養。實驗采用融合度90%左右的第3～4代VSMCs。細胞鑒定采用α-actin免疫熒光染色。實驗分兩組，對照組[無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)處理]和Wbt3a組(終濃度為100 ng/mL的重組Wnt3a處理)。

A:對照組；B：Wnt3a組；C:Transwell實驗分析圖；a:P<0.05，與對照組比較

圖1 Transwen實驗檢測Wnt3a對VSMCs遷移能力的影響

1.2.2Transwell檢測 采用Transwell小室法檢測VSMCs遷移，在24孔培養板插入直徑6.5 mm、硝酸纖維素濾膜孔徑為8 μm的小室，上室加入無血清培養液的VSMCs(3×105個/mL) 100 μL，下室加入含10% FBS的培養液600 μL，于培養箱中作用24 h后取出濾膜，棉簽小心去除上層未遷移細胞，常溫下無水甲醇固定20 min，0.1%結晶紫染色15 min，雙蒸水沖洗后，取下濾膜，下室朝上于顯微鏡下照相。每組設4個小室，每個濾膜上選擇5個視野計數取平均值，實驗重復3次。

1.2.3細胞基質黏附檢測 96孔板包被膠原Ⅰ(20 μg/mL)，在4 ℃下過夜，PBS沖洗后用1%牛血清清蛋白(BSA)在室溫下阻斷1 h，再用無血清的DMEM培養基沖洗，每孔接種3×104個VSMCs，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗后，4%多聚甲醛室溫下固定30 min,0.5%甲苯胺藍染色15 min,雙蒸水沖洗后在顯微鏡下照相，每孔隨機選取5個視野并計數。最后經1%十二烷基硫酸鈉(SDS)裂解細胞后，酶標儀(Infinite M200 Pro)590 nm測光密度(optical density,OD)值。

1.2.4Western blot分析 VSMCs用100 ng/mL的重組Wnt3a蛋白或無菌PBS處理3 d后收集VSMCs，加入含苯甲基磺酰(PMSF)的RIPA裂解液，冰上放置30 min，4 ℃下12 000 r/min 離心40 min，取上清。以BSA為標準，用Bradford比色法對上清進行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，100 V轉移約1 h，溴酚藍到達分離膠的底端即可停止電泳。再將蛋白電泳轉移至硝酸纖維素薄膜(PVDE)上，放入封閉液中37 ℃封閉1 h；加入抗β-catenin、磷酸化β-catenin(Ser675)、GSK-3β，磷酸化GSK-3β(Ser9)、ILK抗體，4 ℃過夜，反復洗膜后，將膜與二抗孵育，室溫輕搖1 h，洗膜后采用增強化學發光檢測系統進行觀察。

2 結 果

2.1Wnt3a促進VSMCs遷移 Transwell實驗顯示Wnt3a組VSMCs遷移的數量明顯高于對照組(P<0.05)，提示Wnt3a刺激后可以顯著增加VSMCs的遷移能力，見圖1。

2.2細胞基質黏附檢測 結果顯示Wnt3a組中VSMCs黏附于膠原Ⅰ的數量較對照組明顯增加(P<0.05)。另外，Wnt3a組的OD值也明顯增加(P<0.05)，見圖2。提示Wnt3a具有提高VSMCs黏附膠原Ⅰ的能力。

2.3Western blot分析結果 為了檢測Wnt3a影響VSMCs遷移和黏附的相關機制，筆者使用Western blot技術檢測VSMCs中β-catenin，磷酸化β-catenin(Ser-G75)，GSK- 3β、磷酸化GSK-3β(Ser)和ILK蛋白水平的表達。結果顯示使用Wnt3a蛋白刺激后，VSMCs中磷酸化β-catenin(Ser675)、磷酸化GSK-3β(Ser9)和ILK蛋白的表達水平均顯著上調(P<0.05)，但是兩組中總的β-catenin和總的GSK-3β的蛋白水平表達沒有明顯變化(P>0.05)，見圖3。

A:對照組；B：Wnt3a組；C：細胞黏附實驗分析圖(細胞計數)，D:細胞黏附實驗分析圖(OD值)；a:P<0.05，與對照組比較

圖2兩組大鼠VSMCs基質黏附能力比較

A:Western blot;B:Western blot分析圖

圖3兩組VSMCs細胞中Wnt相關蛋白表達水平比較

3 討 論

目前研究發現Wnt信號傳導通路可以經下游信號調節細胞骨架結構并影響細胞遷移和黏附，一些Wnt信號通路分子是調節細胞遷移和黏附的重要成分。β-catenin是經典的Wnt信號通路必不可少的調節蛋白[7-9]。Wnt3a是Wnt家族研究較多的成員之一，它可以激活經典的Wnt信號通路并誘導細胞增殖[6]，但Wnt3a對細胞遷移和黏附的影響還未進一步闡明。激活的Wnt/β-catenin信號可以被GSK-3β抑制，GSK-3β使β-catenin N末端磷酸化導致β-catenin降解。但是當β-catenin C末端Ser675位點磷酸化時卻可以激活β-catenin，使β-catenin更易進入細胞核與淋巴細胞增強因子、T細胞因子結合增強轉錄活性[10-12]。本研究發現重組的Wnt3a蛋白刺激大鼠VSMCs后可以增強β-catenin Ser675位點和GSK-3β Ser9(抑制GSK-3β的活性)位點的磷酸化，提示Wnt3a刺激可以激活Wnt/β-catenin信號通路。

VSMCs遷移和增殖可以導致損傷的動脈內膜增生引起動脈粥樣硬化加重和血管內再狹窄。這一系列過程受到細胞外基質、黏附分子及細胞表面的整合素家族等許多蛋白及信號通路的調節[9,12]。ILK是整合素受體下游信號一個重要的分子，它可以通過磷酸化使GSK-3β失活，GSK-3β失活又可以導致Wnt信號傳導通路靶基因的激活，從而調節細胞的增殖、分化及存活。ILK還可以作為分子橋接蛋白與整合素結合，調節肌動蛋白和細胞骨架結構，影響細胞遷移和黏附[13-16]。研究還發現ILK可以通過磷酸化使GSK-3β失活，促進β-catenin核易位并激活經典的Wnt信號通路[14-17]。本研究在大鼠VSMCs中研究發現Wnt3a不僅可以激活經典的Wnt信號通路，還可以增加ILK蛋白水平的表達，并促進VSMCs遷移和黏附，提示Wnt3a可以通過ILK調節VSMCs遷移和黏附。

本研究得出Wnt3a可以通過ILK調節VSMCs遷移和黏附，這有可能成為治療血管疾病和評估預后一個重要的靶點，然而，血管疾病的發生機制復雜并涉及許多信號傳導通路，將來還應該在其他的細胞中和動物模型中進一步探討Wnt3a信號及ILK的機制和作用。

[1]Van DV，Smits JF,Blankesteijn WM.The Wnt/frizzled pathway in cardiovascular development and disease:friend or foe?[J].Eur J Pharmacol,2008,585(2/3):338-345.

[2]Rao TP,Kühl M.An updated overview on Wnt signaling pathways:a prelude for more[J].Circ Res,2010,106(12):1798-1806.

[3]Tsaousi A,Mill C,George SJ.The Wnt pathways in vascular disease:lessons from vascular development[J].Curr Opin Lipidol,2011,22(5):350-357.

[4]Ghatak S,Morgner J,Wickstr?m SA.ILK:a pseudokinase with a unique function in the integrin-actin linkage[J].Biochem Soc Trans,2013,41(4):995-1001.

[5]Kim C,Ye F,Ginsberg MH.Regulation of integrin activation[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2011,27:321-345.

[6]Shin HR,Islam R,Yoon WJ,et al.Pin1-mediated modification prolongs the nuclear retention of β-Catenin in wnt3a-induced osteoblast differentiation[J].J Biol Chem,2016,291(11):5555-5565.

[7]Amin N,Vincan E.The Wnt signaling pathways and cell adhesion[J].Front Biosci (Landmark Ed),2012,17(1):784-804.

[8]Tan CW,Gardiner BS,Hirokawa Y,et al.Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells[J].PLoS One,2012,7(2):e31882.

[9]Parmalee NL,Kitajewski J.Wnt signaling in angiogenesis[J].Curr Drug Targets,2008,9(7):558-564.

[10]Vargas DA,Sun M,Sadykov K,et al.The integrated role of Wnt/β-Catenin,N-Glycosylation,and E-Cadherin-Mediated adhesion in network dynamics[J].PLoS Comput Biol,2016,12(7):e1005007.

[11]Marchand A,Atassi F,Gaaya A,et al.The Wnt/beta-catenin pathway is activated during advanced arterial aging in humans[J].Aging Cell,2011,10(2):220-232.

[12]Mill C,George SJ.Wnt signalling in smooth muscle cells and its role in cardiovascular disorders[J].Cardiovasc Res,2012,95(2):233-240.

[13]Ho B,Hou G,Pickering JG,et al.Integrin-linked kinase in the vascular smooth muscle cell response to injury[J].Am J Pathol,2008,173(1):278-288.

[14]Ho B,Bendeck MP.Integrin linked kinase (ILK) expression and function in vascular smooth muscle cells[J].Cell Adh Migr,2009,3(2):174-176.

[15]Moraes JA,Frony AC,Dias AM,et al.Alpha1beta1 and integrin-linked kinase interact and modulate angiotensin II effects in vascular smooth muscle cells[J].Atherosclerosis,2015,243(2):477-485.

[16]Mcdonald PC,Fielding AB,Dedhar S.Integrin-linked kinase--essential roles in physiology and cancer biology[J].J Cell Sci,2008,121(Pt 19):3121-3132.

[17]Lu C,Yu X,Zuo K,et al.Tripterine treatment improves endothelial progenitor cell function via integrin-linked kinase[J].Cell Physiol Biochem,2015,37(3):1089-1103.

Wnt3aregulatesmigrationandadhesionofvascularsmoothmuscularcellsviaintegrin-linkedkinase*

WuXiaolin,ZhuRui△,LiBin,LiuWenwei,ZhouQing,ZhaoYuqin

(DepartmentofCardiology,XiangyangMunicipalCentralHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofArtsandScience,Xiangyang,Hubei441000,China)

ObjectiveTo investigate the effects and related mechanism of recombinant Wnt3a protein on vascular smooth muscle cells(VSMCs) migration and adhesion.MethodsPrimary rat VSMCs were cultured.The experiment was divided into the Wnt3a group and control group.The VSMC migration ability was detected by Transwell experiment.And the ability of VSMC adhesion to extracelluar matrix was detected by the celluar matrix adhesion assay.The protein expression levels of β-catenin,phosphor-β-catenin (Ser675),GSK-3β,phosphor-GSK-3β(Ser9) and integrin-linked kinase(ILK) in VSMCs were detected by Western blot and analyzed.ResultsThe number of VSMCs migration in the Wnt3a group was significantly higher than that in the control group (P<0.05).Compared with the control group,the number of VSMCs adhesion to collagen Ⅰ and the optical density value in the Wnt3a group were significantly increased (P<0.05),and the protein expression levels of β-catenin,Ser675,GSK-3β,Ser9 and ILK in the Wnt3a group were significantly up-regulated (P<0.05).ConclusionWnt3a can regulate VSMCs migration and adhesion by ILK.

] Wnt proteins;muscle,smooth,vascular;cell movement;cell adhesion;protein-serine-threonine kinases

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.004

湖北省自然科學基金青年項目(2016CFB344)。

吳校林(1982-)，博士，主治醫師，主要從事冠心病相關機制的研究。△

，E-mail:zhurui@medmail.com.cn。

R346

A

1671-8348(2017)36-5049-03

2017-08-18

2017-09-26)