恩度促進與肺癌細胞A549共培養體系中的HUVEC凋亡及其機制研究

馬 芬, 馮 鋒

(江蘇省南京明基醫院 腫瘤科, 江蘇 南京, 210019)

恩度促進與肺癌細胞A549共培養體系中的HUVEC凋亡及其機制研究

馬 芬, 馮 鋒

(江蘇省南京明基醫院 腫瘤科, 江蘇 南京, 210019)

恩度; 肺癌細胞A549; HUVEC凋亡; 機制

本研究對恩度促進與肺癌細胞A549共培養體系中的HUVEC凋亡及其機制進行了研究，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

購買煙臺麥得津生物工程有限公司生產的重組人血管內皮抑制素，購買中國科學院上海細胞庫提供的人臍靜脈內皮細胞HUVECs、人非小細胞肺癌A549細胞株，購買湖南長沙長錦科技有限公司生產的CO2培養箱，購買杭州四季青公司生產的批號為110213的胎牛血清，購買武漢博士德生物工程有限公司生產的Bax, Bcl-2抗體、鏈霉素親和生物素酶復合物(SABC), 購買南京凱基生物公司生產的Annexin V2FITC凋亡檢測試劑盒，購買日本Olympus IX71倒置熒光顯微鏡奧林巴斯BX51熒光顯微鏡，購買新加坡ESCO公司生產的超凈工作臺，購買GIBCO生產的DMEM與RPMI1640培養基，購買美國Sigma公司生產的3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT), 購買日本Osaka Takeda公司生產的O-(氯乙酰-氨基酰基)煙曲霉醇(TNP-470), 購買美國Moleculor Devices生產的SPECTRAmax190酶聯分析儀, Corning Transwll遷移小室直徑、孔徑分別為6 mm、5 μm。

1.2 方法

1.2.1 A549細胞與HUVECs細胞共培養體系的建立: 將對數生長期的A549取出來，對其進行消化，在此過程中將0.25%胰腺充分利用起來，在RPMI-1640培養基中加入，將A549單細胞懸液制備出來，密度為2×104細胞/mL。同時將對數生長期的HUVECs細胞取出來，對其進行消化，在此過程中將0.01%EDTA充分利用起來，在RPMI-1640培養基中加入，將HUVECs單細胞懸液制備出來，密度為1×105細胞/mL。分別在A549細胞、HUVECs上接種6孔板Transwell小室的上室、下室，在RPMI-1640培養基中加入，其含10%胎牛血清，培養成分為100 U/mL鏈霉素+100 U/mL青霉素，以使上室細胞培養在培養基中得到切實有效的保證。在37 ℃、5% CO2培養箱中對Transwell板進行培養。

1.2.2 恩度共培養體系中對HUVECs生長抑制作用: 在下室HUVECs長到75%～85%融合度的情況下，用含藥培養基處理細胞。恩度的濃度分別為10、20、40、80、100 μg/mL, 陽性對照組為終濃度為25 μg/mL的TNP-470, 空白對照組加100 μL培養基代替，另將對照孔設置為本底，其屬于無細胞培養液，體積同上，含有相應濃度藥物，每組將3個平行孔設置起來。進行2 d的孵育后將每孔的含藥血清棄去，將1 mL不含血清的培養基重新加入，另將20 μL 5 mg/mL的MTT液加入，在培養箱中進行4 h的孵育，將液體棄去，將100 μL二甲基亞砜(DMSO)加入每孔，在振蕩器中進行10 min的振蕩，在580 nm波長處采用酶聯免疫檢測儀對OD值進行測定，計算出生長抑制率，方法為對照組與實驗組OD值之差與對照組OD值的百分率，實驗重復3次。

1.2.3 HUVECs凋亡測定: 對細胞進行接種，并對其進行藥物處理，然后進行2 d的培養，對細胞凋亡進行測定，在此過程中將Annexin V-FITC試劑盒充分利用起來，用胰酶-EDTA消化下室HUVECs細胞，將細胞收集起來，將消化終止，在此過程中將培養基充分利用起來。每個樣本計數1×104細胞。對收集的細胞進行2遍的潤洗，在此過程中將冷的PBS充分利用起來，用500 μL結合緩沖液懸浮細胞，將5 μL Annexin V-FITC加入其中，以輕柔的動作混勻。測定前將5 μL PI加入其中，同時在暗處放置，進行15 min的避光反應。上機測定，每組平行2個樣本。

1.2.4 恩度對HUVECs中Bcl-2與Bax凋亡蛋白的影響檢測: 對恩度對共培養體系中HUVECs中Bcl-2與Bax凋亡蛋白的影響進行評價，在此過程中將鏈霉親和生物素酶復合物(SABC)方法充分利用起來。將HUVECs接種在玻片上，恩度的濃度為10、20、40 μg/mL。進行2 d的培養后用PBS對細胞進行3次清洗，每次1 min，室溫下對4%多聚甲醛進行90 min的固定，進行3次洗滌，在此過程中將PBS充分利用起來，每次2 min。進行30 min的處理，在此過程中將H2O2充分利用起來，進行3次洗滌，在此過程中將PBS充分利用起來，每次2 min, 然后在37 ℃的溫度下對10%封閉血清進行20 min的孵育。將1∶200 Bcl-2與1∶200 Bax抗體加入其中，在37 ℃的溫度下進行2 h的孵育，之后將二抗加入其中，進行20 min的孵育，用PBS洗滌，對樣本進行處理，在此過程中將SABC溶液充分利用起來。最后用0.3 mg/mL 3, 3′-二氨基聯苯胺(DAB)處理，鏡下對反應時間進行控制，輕度復染、洗滌、封片，在此過程中分別將蘇木素、PBS、中性樹膠充分利用起來。采用Image-ProPlus圖像分析軟件鏡下拍片。陰性對照組用PBS將一抗取代掉。

1.2.5 Bcl-2與Bax蛋白檢測: 進行Western blotting, 對細胞進行消化并將其收集起來，在此過程中將胰酶-EDTA充分利用起來，將400 μL裂解液加入其中前將冰冷PBS加入其中進行3次潤洗，在冰上放置對細胞進行30 min的裂解。在4 ℃離心機中進行離心，速率和時長分別為14 000 r/min、5 min, 將上清液提取出來，對蛋白質濃度進行測定，然后進行SDS-PAGE轉膜。室溫下對TBST進行1 h的封閉，在此過程中將含5%胎牛血清白蛋白(BSA)充分利用起來，將Bcl-2與Bax抗體加入，在4 ℃溫度的搖床過夜。將1∶1 000 HRP-IgG二抗加入其中雜交，洗膜后顯色。在凝膠成像系統中放置，分析Bcl-2與Bax蛋白的相對表達量。

1.3 統計學分析

應用統計軟件SPSS 16.0分析所得數據，用均數±標準差表示所有數據，各組數據組間差異比較用One-way ANOVA方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

恩度對HUVECs增殖抑制作用、誘導HUVECs細胞凋亡情況分析見表1。恩度對HUVECs中Bcl-2與Bax蛋白表達的影響分析見表2。

表1 恩度對HUVECs增殖抑制作用、誘導HUVECs細胞凋亡情況分析

與正常組比較, *P<0.05; 與TNP-470比較, #P<0.05。

表2 恩度對HUVECs中Bcl-2與Bax蛋白表達的影響分析 %

與空白組比較, *P<0.05; 與TNP-470比較, #P<0.05。

3 討 論

重組人血管內皮抑制素注射液(恩度)屬于一種血管內皮生長抑制劑，特點為新型、多靶點，能夠對腫瘤血管生成進行抑制，在多種腫瘤的治療中均得到了有效應用[1-3]。相關醫學研究[6-8]表明，恩度能夠對血管生成及腫瘤生長、侵襲、遷移進行抑制，途徑為在腫瘤微血管內皮細胞特異性地作用。近年來，在腫瘤患者的發病率及死亡率中，肺癌在日益加重的環境污染、吸煙等因素的影響下已經位居首位[9]。通常情況下，恩度是臨床治療肺癌過程中通常采用的藥物[10]。現階段，很多相關醫學研究均對恩度對血管內皮生長因子、成纖維生長因子等的表達進行調控進行了報道，但是卻很少有相關醫學研究對恩度對血管內皮細胞凋亡的影響進行報道。

本研究結果顯示，恩度對HUVECs增殖抑制率、誘導HUVECs細胞凋亡率均隨著濃度的提升而提升(P<0.05), 10、20 μg/mL恩度對HUVECs增殖抑制率、誘導HUVECs細胞凋亡率均顯著低于25 μg/mL TNP-470(P<0.05), 80、100 μg/mL恩度對HUVECs增殖抑制率、誘導HUVECs細胞凋亡率均顯著高于25 μg/mL TNP-470(P<0.05), 但40 μg/mL恩度、25 μg/mL TNP-470對HUVECs增殖抑制率、誘導HUVECs細胞凋亡率之間的差異均無統計學意義(P>0.05), 20、40、80、100 μg/mL恩度、25 μg/mL TNP-470誘導HUVECs細胞凋亡率均顯著高于正常組(P<0.05), 但10 μg/mL恩度、正常組誘導HUVECs細胞凋亡率之間的差異無統計學意義(P>0.05); 免疫細胞化學、Western blotting下20、40 μg/mL恩度、25 μg/mL TNP-470對HUVECs中Bcl-2蛋白表達均顯著低于空白組(P<0.05), Bax蛋白表達均顯著高于空白組(P<0.05), 10 μg/mL恩度對HUVECs中Bcl-2蛋白表達均顯著高于25 μg/mL TNP-470(P<0.05), Bax蛋白表達均顯著低于25 μg/mL TNP-470(P<0.05), 但20、40 μg/mL恩度、25 μg/mL TNP-470對HUVECs中Bcl-2與Bax蛋白表達差異均無統計學意義(P>0.05), 10 μg/mL恩度、空白組對HUVECs中Bcl-2與Bax蛋白表達差異均無統計學意義(P>0.05), 說明恩度促進與肺癌細胞A549共培養體系中的HUVEC凋亡的機制為對Bcl-2家族蛋白進行調控。

[1] 許成云, 倪慶桂, 樊馨, 等. 重組人血管內皮抑制素對肺微血管內皮細胞增殖及其周期分布的影響[J]. 臨床腫瘤學雜志, 2009, 14(5): 410-413.

[2] 李忠義, 劉江秋, 徐璐, 等. 重組人血管內皮抑制素對小鼠Lewis肺癌腫瘤抑制作用[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2003, 10(4): 274-276.

[3] 殷宗寶, 王洪武, 鄧超, 等. 重組人血管內皮抑制素注射液對低O2高CO2肺動脈高壓大鼠IL-6, eNOS, VEGF 的影響[J]. 實用醫學雜志, 2010, 26(18): 3311-3313.

[4] 辛慶鋒, 俊輝. 冬凌草甲素抗腫瘤作用機制研究進展[J]. 醫學綜述, 2008, 14(3): 455-456.

[5] 王玉彬, 李迪諾, 岳莉. 重組人血管內皮抑制素對人胃癌MGC-803細胞株VEGF表達的影響[J]. 江蘇醫藥, 2011, 37(13): 1504-1506.

[6] 張春玲, 吳立軍, 左海軍, 等. 冬凌草甲素通過改變Bax/Bcl-xL表達激活caspase-3誘導A375-S2細胞凋亡[J]. 中國藥理學通報, 2004, 20(6): 669-672.

[7] 蔡魯平, 蔡瑞興, 翟繼萌. Glubran2膠介入栓塞在肺癌咯血中的應用效果[J]. 實用心腦肺血管病雜志, 2014, 22(10): 93-95.

[8] 王志強. sFRP、WIF-1、CD133、CD44在肺癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 實用心腦肺血管病雜志, 2014(02): 8-9.

[9] Feng L, Xu Y H, Wang S S, et al. Preventative Effects of 4, 4′-Diphenylmethane-bis(methyl) Carbamate Isolated from Cortex Mori on Human Umbilical Vein Endothelial Cell Dysfunction Induced by Advanced Glycation End Products[J]. Phytother Res, 2012, 26(3): 412-419.

[10] ZHANG Y, WU Y, Tashiro S, et al. Involvement of PKC signal pathways in oridonin-induced autophagy in HeLa cells: a protective mechanism against apoptosis[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 378(2): 273-278.

R 734.2

A

1672-2353(2017)23-081-03

10.7619/jcmp.201723026

2017-06-28