大鼠慢傳輸型便秘發病的Cajal間質細胞特異性蛋白c-kit-SCF調控機制研究

劉志昊, 李曙光, 虞向陽, 陳建立, 曹文斌, 趙永魁, 張國志

(1. 河北省唐山市開灤總醫院范各莊醫院 普通外科, 河北 唐山, 063108; 2. 華北理工大學附屬醫院 普通外科, 河北 唐山, 063108)

大鼠慢傳輸型便秘發病的Cajal間質細胞特異性蛋白c-kit-SCF調控機制研究

劉志昊1, 李曙光2, 虞向陽2, 陳建立2, 曹文斌2, 趙永魁2, 張國志2

(1. 河北省唐山市開灤總醫院范各莊醫院 普通外科, 河北 唐山, 063108; 2. 華北理工大學附屬醫院 普通外科, 河北 唐山, 063108)

目的分析大鼠慢傳輸型便秘發病的Cajal間質細胞特異性蛋白c-kit的調控機制。方法成年雄性SD大鼠皮下注射嗎啡25 mg/kg, 共45 d, 誘導大鼠慢傳輸型便秘發病模型。分析便秘大鼠日均糞便粒數和質量及首粒黑便排出時間, Real-time PCR及Western blot法檢測便秘大鼠SCF及c-kit蛋白表達水平，酶聯免疫吸附測定法分析便秘大鼠體內炎癥因子水平變化。結果便秘組大鼠日均糞便粒數明顯降低，便粒質量明顯升高，首粒黑便排出時間明顯延長，且與對照組相比存在顯著差異(P<0.05); 便秘組大鼠SCF及c-kitmRNA及蛋白表達水平明顯降低，炎癥因子IL-1β、IL-2及IL-10水平明顯升高，且與對照組相比存在顯著差異(P<0.05)。結論SCF及c-kit蛋白調控了大鼠慢傳輸型便秘發病過程，且此過程與炎癥反應有關。

慢性傳輸型便秘; 熒光定量PCR; 炎癥反應; 干細胞因子配體

便秘的發病原因有多方面，如生活方式的改變、遺傳因素、精神心理因素、器官動力因素等[1]。Cajal間質細胞是腸道內的慢波起搏細胞，參與調控了腸神經信號的傳遞過程[2]。c-kit蛋白及其配體干細胞因子(SCF)結合后激活的細胞內信號轉導通路是Cajal表型發生變化的重要原因[3]。本研究分析大鼠慢傳輸型便秘發病的Cajal間質細胞特異性蛋白c-kit的調控機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑

清潔級SD大鼠購自中國科學院上海生命科學研究院，許可證號為SYXK(滬)2013-0060。所有大鼠體質量220～240 g, 適應性飼養1周。自由飲食，維持飼養環境溫度20 ℃～22 ℃, 濕度55%～65%, 光照12 h/d。復方苯乙哌啶購自常州康普藥業有限公司; 引物由上海生工合成; c-kit及SCF檢測試劑盒購自Abcam公司; β-actin蛋白檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司; IL-1β、IL-2及IL-10蛋白檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所; 7500熒光定量PCR購自ABI公司; 熒光定量PCR檢測試劑盒購自Omega公司。其余試劑為市售分析純。

1.2 分組及模型復制

24只SD大鼠隨機分為對照組和慢傳輸型便秘發病組。慢傳輸型便秘組大鼠每日皮下注射嗎啡25 mg/kg, 共45 d, 誘導大鼠慢傳輸型便秘發病。對照組大鼠給予等量的生理鹽水皮下注射，共45 d。

1.3 Real-time PCR檢測相關蛋白表達

采用SYBR GreenI法按照Omega試劑盒說明書進行。反應體系為20 μL, 擴增程序為: 95 ℃、30 s, 93 ℃、5 s, 60 ℃、20 s, 共36個循環。SCF引物: 5′-CATGCTTTAAGGCCTTTGTCACGAG-3′, 5′-GGAGATGGCAGTTGTGCAGCTA-3′; c-kti引物: 5′-AGATGACGAGCTGGCTCTGGA-3′, 5′-CTGGCTGCCAAATCTXTGTGAA-3′; β-actin: 5′-GGCACAG TCAAGGC TGAGAATG-3′, 5′-A TGG TGG TGAAGACGCCAGTA-3′。

1.4 Western blot法檢測相關蛋白表達

根據待檢測蛋白質的大小選擇合適濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳(40 μg/泳道); 電泳后剝離SDS-PAGE膠進行半干法轉膜(PVDF膜, 100 V, 1.5 h); 轉膜后用5.0%脫脂牛奶封閉1 h; 一抗(1∶200)孵育2 h; 將PVDF膜轉入裝有磷酸鹽緩沖液的洗膜盒中，加入適量的TBST, 洗滌3次(10 min/次); 二抗(1∶200)孵育2 h; 轉入裝有磷酸鹽緩沖液的洗膜盒中洗滌3次(10 min/次); 顯影并拍照。以β-actin為內參。

1.5 酶聯免疫吸附測定

IL-1β蛋白檢測試劑盒購自R&D公司; IL-2蛋白檢測試劑盒購自Abcam公司; IL-10蛋白檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。所有的檢測操作過程均按照試劑盒說明書進行。

1.6 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料用平均數±標準差表示，兩組比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 便秘大鼠日均糞便粒數和質量及首粒黑便排出時間分析

研究發現，便秘組大鼠日均糞便粒數明顯降低，便粒質量明顯升高，首粒黑便排出時間明顯延長，與對照組相比有顯著差異(P<0.05)，見表1。

表1 便秘大鼠日均糞便粒數和質量及首粒黑便排出時間分析

與對照組比較, *P<0.05。

2.2 Real-time PCR分析便秘大鼠SCF及c-kit蛋白表達水平

Real-time PCR檢測發現便秘組大鼠SCF及c-kit的水平明顯降低，且與對照組相比有顯著差異(P<0.05), 見表2。

表2 Real-time PCR分析便秘大鼠SCF及c-kit蛋白表達水平

與對照組比較, *P<0.05。

2.3 Western blot分析便秘大鼠SCF及c-kit蛋白表達水平

Western blot檢測發現便秘組大鼠SCF及c-kit的水平明顯降低，且與對照組相比存在顯著差異(P<0.05), 見表3、圖1。

2.4 酶聯免疫吸附測定法分析便秘大鼠體內炎癥因子水平變化

酶聯免疫吸附測定檢測發現，便秘組大鼠炎癥因子IL-1β、IL-2及IL-10水平明顯升高，且與對照組相比存在顯著差異(P<0.05), 見表4。

表3 Western blot分析便秘大鼠SCF及c-kit蛋白表達水平

與對照組比較, *P<0.05。

圖1 Western blot 分析便秘大鼠SCF 及c-kit 蛋白表達水平

表4 酶聯免疫吸附測定法分析便秘大鼠體內炎癥因子水平變化

與對照組比較, *P<0.05。

3 討 論

Cajal間質細胞是腸道慢波信號起搏細胞，參與調控了腸神經信號傳遞過程。Cajal間質細胞的缺失可能會引起胃腸功能的異常。便秘是臨床上常見的胃腸功能紊亂性疾病，其發病過程可能與Cajal間質細胞內的相關調控蛋白表達異常有關。本研究分析大鼠慢傳輸型便秘發病的Cajal間質細胞特異性蛋白c-kit的調控機制時發現，便秘組大鼠日均糞便粒數明顯降低，便粒質量明顯升高，首粒黑便排出時間明顯延長，且與對照組相比存在顯著差異; 便秘組大鼠SCF及c-kitmRNA及蛋白表達水平明顯降低，炎癥因子IL-1β、IL-2及IL-10水平明顯升高，且與對照組相比存在顯著差異。因此, SCF及c-kit蛋白調控了大鼠慢傳輸型便秘發病過程，且此過程與炎癥反應有關。

c-kit是細胞內典型的III型受體酪氨酸激酶，在細胞的增殖、遷移、凋亡等過程中均有參與。證據[4]顯示c-kit蛋白的異常表達與胃腸道功能的紊亂密切相關。在分析針刺對肝硬化大鼠胃腸動力及胃腸Cajal細胞c-kit表達影響的研究[5]中發現，針刺足三針能明顯改善肝硬化大鼠的小腸運動功能，增加大鼠胃腸道c-kit的含量從而改善消化道癥狀。在分析c-kit在蒽醌類瀉劑所致腸動力減退發病機制中作用的研究[6]中也證實，蒽醌類瀉劑所致腸動力減退可能與結腸組織中c-kit蛋白表達下調有關。張靜瑜等[7]也發現SCF/c-kit的過度激活導致的ICC發生變化可能是IBS的內臟敏化發生的最為重要的基礎。以往的研究[8]也發現SCF過度激活c-kit導致的ICC異常電活動的重要原因。

本研究發現，便秘組大鼠SCF及c-kitmRNA及蛋白表達水平明顯降低，且與對照組相比存在顯著差異，提示二者表達異常也與便秘大鼠的發病過程密切相關。炎癥反應是細胞內幾乎所有病理過程的共同表現，其也與胃腸功能紊亂密切相關[9]。以往的研究[10]也發現胃腸道紊亂也與炎癥過程有明顯的相關性。在對加味六磨湯治療結直腸癌術后早期炎癥性腸梗阻的臨床研究[11]中也發現，加味六磨湯治療腹腔鏡結直腸癌切除術后早期炎癥性腸梗阻療效確切，可顯著改善患者便秘情況，提高臨床療效，降低不良反應的發生，提高生存質量。因此, SCF及c-kit蛋白調控了大鼠慢傳輸型便秘發病過程，且此過程與炎癥反應有關。

[1] 郝艷冰, 陶華潔, 喬秋閣. 結腸慢傳輸型便秘患者焦慮、抑郁狀況及生活質量調查[J]. 中國醫藥導報, 2015, 5(32): 53-56.

[2] 黃偉, 湯禮軍, 張國虎, 等. 大黃素致小鼠瀉劑結腸形成過程中Cajal間質細胞及SCF/c-Kit的動態變化[J]. 中國普外基礎與臨床雜志, 2016, 9(4): 406-410.

[3] 田姣, 王寶西, 江遜. 胃腸道Cajal間質細胞與干細胞因子/c-kit信號系統的研究進展[J]. 臨床兒科雜志, 2013, 8(4): 385-388.

[4] 孫浩, 李衛, 孫可心. 胃腸間質瘤c-Kit和PDGFRA基因突變分析[J]. 解放軍醫藥雜志, 2015, 5(12): 36-40.

[5] 姜承勛. 針刺對肝硬化大鼠胃腸動力及胃腸Cajal細胞c-kit表達的影響[D]. 廣州中醫藥大學, 2013.

[6] 霍明東, 丁曙晴, 丁義江, 等. c-kit在蒽醌類瀉劑所致腸動力減退發病機制中的作用[J]. 江蘇醫藥, 2013, 6(11): 1250-1253.

[7] 張靜瑜, 黃裕新, 秦明, 等. SCF/c-kit過度激活在腸易激綜合征內臟敏化中的作用[J]. 山西醫科大學學報, 2012, 12(3): 177-181.

[8] 王景杰, 秦明, 劉震雄, 等. 干細胞因子/c-kit在腸易激綜合征中的作用和地位[J]. 醫學與哲學(B), 2012, 9(8): 74-75.

[9] 張麗, 陳明鍇, 鄧琴. 炎癥免疫與功能性胃腸病[J]. 世界華人消化雜志, 2011, 6(26): 2741-2745.

[10] 劉艷紅, 張明鑫, 關波, 等. 大承氣湯通過抑制炎癥反應來改善大鼠炎癥相關性胃腸動力障礙[J]. 山西醫科大學學報, 2015, 10(5): 411-416.

[11] 沈江立, 李娜, 焦云婷. 加味六磨湯治療結直腸癌術后早期炎癥性腸梗阻臨床研究[J]. 中醫學報, 2017, 8(3): 325-328.

Studyontheregulationmechanismofspecificproteinsc-kitofinterstitialcellsofCajalinthepathogenesisofslowtransitconstipationinrats

LIUZhihao1,LIShuguang2,YUXiangyang2,CHENJianli2,CAOWenbin2,ZHAOYongkui2,ZHANGGuozhi2

(1.DepartmentofGeneralSurgery,Fan′gezhuangHospitalofTangshanKailuanGeneralHospital,Tangshan,Hebei, 063108; 2.DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei, 063108)

ObjectiveThe explore regulation mechanism of specific proteins c-kit of interstitial cells of Cajal in the pathogenesis of slow transit constipation in rats.MethodsSlow transit constipation in rat model was duplicated by injections of morphine (25 mg/kg, 45 d). The number and weight of fecal granule were assayed. Daily average number of fecal particles, quality, and the time for first black discharge were analyzed. At the same time, the c-kit and SCF expression were detected by Real-time PCR and Western blot. The changes of inflammatory factors such as IL-1β, IL-2 and IL-10 were also detected by ELISA.ResultsDaily average number of fecal particles in constipation group was decreased, quality was higher, and the first time for first black discharge was prolonged, which showed significant differences (P<0.05). The expression levels of c-kit and SCF were decreased significantly, and levels of inflammatory factors IL-1β, IL-2 and IL-10 were higher in constipation rats than the controls (P<0.05).ConclusionThe pathogenic progress of slow transit constipation rats are regulated, which is also related with inflammatory reactions.

slow transit constipation rats; fluorescent quantitative PCR; inflammatory reaction; stem cell factor ligands

2017-06-22

河北省衛生廳項目(20150517)

張國志

R 442.2

A

1672-2353(2017)23-043-03

10.7619/jcmp.201723013