膿毒癥導致ALI/ARDS患者外周血TLR4及血清TNF-α、SP-A的變化及相關性分析

朱 濱* 吳葉順

（1 蘇州大學附屬第三醫院 重癥醫學科，江蘇 常州 213003；2 蘇州大學附屬第三醫院 心內科，江蘇 常州 213003）

膿毒癥導致ALI/ARDS患者外周血TLR4及血清TNF-α、SP-A的變化及相關性分析

朱 濱1* 吳葉順2

（1 蘇州大學附屬第三醫院 重癥醫學科，江蘇 常州 213003；2 蘇州大學附屬第三醫院 心內科，江蘇 常州 213003）

目的 探討膿毒癥導致ALI/ARDS患者外周血TLR4及血清TNF-α、SP-A的表達及相關性分析。方法 20例膿毒癥導致ALI/ARDS患者的外周血在治療前和治療后被收集。單核細胞分離后檢測TLR4 mRNA水平，ELISA方法檢測血清TNF-α和SP-A水平。結果 16例治愈的膿毒癥導致ALI/ARDS患者治療后TNF-α和SP-A水平顯著低于治療前。單核細胞TLR4 mRNA水平、血清TNF-α和SP-A水平相互之間pearson相關分析顯示正相關。結論 膿毒癥導致ALI/ARDS患者單核細胞TLR4 mRNA水平、血清TNF-α和SP-A水平和病情的急性炎性反應呈正相關。

膿毒癥；急性呼吸窘迫綜合征；TLR4；TNF-α；SP-A

膿毒癥（sepsis）是急診重癥領域極為常見的疾病，膿毒癥的定義最近由2.0版變為3.0版。但是其本質是機體對感染的反應失調，導致了呼吸、循環等重要臟器的功能失調，甚至危及生命[1]。急性肺損傷（acute lung injury，ALI）以及柏林指南后統稱為急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）的肺部損傷是膿毒癥臟器損傷中最易出現的并發癥[2-3]，但是，到目前為止，膿毒癥如何從炎性介質釋放階段到導致ALI/ARDS的發生發展，其中機制尚未完全明確[4]。

本文從膿毒癥導致ALI/ARDS患者外周血Toll樣受體4（Tolllike receptors 4，TLR4）、血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及肺表面活性物質A（surfactant proteins-A，SP-A）水平的變化和相關性分析，來試圖闡述膿毒癥導致ALI/ARDS的部分機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料：2015年7月至2017年6月蘇州大學附屬第三醫院（常州市第一人民醫院）重癥醫學科收治的20例符合膿毒癥導致ALI/ARDS患者[1-3]，臨床治療方法根據指南包括原發病灶的引流、抗感染治療、營養支持及補液維持水電平衡等治療[1-3]。20例患者（男13例，女7例），年齡為（62.1±17.4）歲；治愈16例（男11例，女5例），治愈患者病因分別為肺部感染（4例）、腹腔感染（10例）和皮膚軟組織感染（2例）；死亡4例患者（男2例，女2例），病因分別為肺部感染（2例），腹腔感染（2例）。收住入ICU當時抽患者外周血標本2管（治療前），治療好轉轉出ICU或治療無效患者死亡前抽患者外周血標本2管（治療后）。第1管行Ficoll淋巴細胞分離液，根據檢測說明書分離出單核細胞后予以放置于-80 ℃冰箱保存備用（細胞濃度：1×106）。同時患者抽取的第2管外周血予以放置離心機（3000 r/min）離心10 min后，血清放置入冰箱（-80 ℃）保存。

1.2 方法

1.2.1 試劑：血清TNF-α檢測用酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（博奧深生物工程有限公司）；血清SP-A檢測用ELISA試劑盒（西唐生物制品有限公司）。TLR4引物由上海生工所設計（上游：5'-GCCGGAAAGTTATTGTGGT GGT-3'和下游：5'-ATGGGTTTTAGGCGCAGAGTTT-3'）。

1.2.2 檢測方法：血清中SP-A/TNF-α的濃度采用ELISA方法檢測，操作嚴格按試劑盒說明進行。TLR4 mRNA檢測（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）：按照說明書操作提取總RNA，反轉錄按照試劑盒說明書操作。

圖1 膿毒癥導致ALI/ARDS 16例治愈患者治療前和治療后外周血TLR4及血清TNF-α、SP-A的變化。a，治療前和治療后外周血TLR4水平的變化（#P＞0.05）；b，治療前和治療后外周血清TNF-α水平的變化（*P＜0.05）；c，治療前和治療后外周血清SP-A水平的變化（*P＜0.05）

圖2 膿毒癥導致20例ALI/ARDS患者外周血TLR4及血清TNF-α、SP-A的相關性分析。a，外周血TLR4與血清TNF-α相關性分析（r=0.65，P＜0.05）；b，外周血TLR4與血清SP-A相關性分析（r=0.56，P＜0.05）；c，血清TNF-α與SP-A 相關性分析（r=0.74，P＜0.05）

1.3 統計學方法：數據分析：PASW Statistics 18.0軟件。同組計量資料治療前后以配對t檢驗進行統計分析，同一時間點標本不同檢測指標用Pearson相關分析，α=0.05作為數據的檢驗水準，P＜0.05為數據差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 膿毒癥導致ALI/ARDS共16例治愈，4例死亡。16例治愈患者治療前和治療后外周血TLR4水平差異無統計學意義（圖1a，#P＞0.05）；16例治愈患者治療前和治療后外周血清TNF-α水平（圖1b，*P＜0.05）、SP-A水平（圖1c，*P＜0.05）差異有統計學意義。

2.2 膿毒癥導致20例ALI/ARDS患者外周血TLR4與血清TNF-α（圖2a，r=0.65，P＜0.05）、外周血TLR4與血清SP-A（圖2b，r=0.56，P＜0.05）、血清TNF-α與SP-A（圖2c，r=0.74，P＜0.05）呈正相關。

3 討 論

在膿毒癥過程中，會有許多感染原發灶產生的諸如脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）的刺激物。LPS進入機體的有效循環血液中與LPS結合蛋白（LPS binding protein，LBP）耦合，形成的復合體再次作用于單核巨噬細胞膜表面的受體CD14分子，LPS/LBP/CD14復合物作用跨膜受體TLR4，產生各級炎性因子，逐級放大致炎作用[5]。因此，膿毒癥導致的包括急性呼吸窘迫呼吸綜合征或者其他的臟器損傷，病情發展的嚴重與否與TNF-α等促炎性因子又存在密切的關聯[5]。在課題組前期的研究中，發現炎性因子與SP-A也有一定的關聯[6]。

本文中的研究結果表明，在治療好轉（治愈組）的16例患者中，治療前和治療后的血清TNF-α、SP-A比較差異有統計學意義。這一點也與絕大部分國內的分析結果類似[5-6]，在病情好轉后，炎性因子TNF-α，代表肺損傷嚴重程度的SP-A水平都會顯著下降。但是外周血TLR4 mRNA的水平下降后與治療前卻無統計學差異，可能是本研究中的病例數過少導致的。同時研究的另一項不足之處在于，本項研究中膿毒癥導致ALI/ARDS的確診患者數目較少，并且有4例死亡。因此無法作出治愈組和死亡組2組的數據比較和分析。

但是，我們隨后作出了所有患者治療前治療后外周血TLR4及血清TNF-α、SP-A的相關分析。結果顯示這3個指標兩兩顯示為正相關。結果顯示隨著病情的進展，無論是膿毒癥導致的ALI/ARDS病情好轉或者死亡，外周血TLR4及血清TNF-α、SP-A的指標上升和下降的趨勢是相同的。此項研究的結果也符合課題組前期的研究結果及假說推論[6]，即CD14-TLR4-NF-κB信號傳導通路在膿毒癥導致的ALI/ARDS過程中，炎性因子（TNF-α等）水平的高低決定了肺臟損傷（SP-A等指標）的嚴重程度。因此，如何在炎癥通路的過程中干預或者藥物治療來減輕臟器損傷的程度，是我們下一步研究的問題。

[1] Djillali A,Eric B,Pierre-Edouard B,et al.Corticosteroids in the Treatment of Severe Sepsis and Septic Shock in Adults:A Systematic Review[J].JAMA,2009,301(22):2362-2375.

[2] Danner RL,Elin RJ,Hosseini JM,et al.Endotoxemia in human septic shock[J].Chest,1991,99(1):169-175.

[3] Fehrenbach H,Brasch F,Uhlig S,et al.Early alterations in intracellular and alveolar surfactant of the rat lung in response to endotoxin[J].Am J Respir Crit Care Med,1998,157(5 Pt 1):1630-1639.

[4] Uhlig S.Ventilation-induced lung injury and mechanotransduction:stretching it too far[J]? Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2002,282(5):L892-896.

[5] Schumann RR,Leong SR,Flaggs GW,et al.Structure and function of lipopolysaccharide binding protein[J].Science,1990,249(4975):1429-1431.

[6] Zhu B,Zheng F,Liu N,et al.Diagnostic Value of Surfactant Protein-A in Severe Acute Pancreatitis-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome[J].Med Sci Monit,2014,26(20):1728-1734.

Expression and Correlation Analysis of Toll-like Receptors 4, TNF-α and SP-A in Sepsis Induced ALI/ARDS Patients

ZHU Bin1, WU Ye-shun2
(1 Department of Critical Care Medicine, the Third Aff i liated Hospital of Soochow University, Changzhou 213003, China;2 Department of Cardiology, the Third Aff i liated Hospital of Soochow University, Changzhou 213003, China)

Objective To investigate the expression and correlation analysis of Toll-like receptors 4, TNF-α and SP-A in sepsis induced ALI/ARDS patients. Methods Peripheral blood samples were measured prior to and following treatment in 20 patients with sepsis induced ALI/ARDS patients, in which monocytes were isolated and RT-PCR method was used to detect the expression of TLR4 mRNA.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was used to measure serum level of TNF-α and SP-A. Results The post-treatment serum levels of TNF-α and SP-A levels were significantly decreased compared with pre-treatment in the 16 cured cases (P＜0.05). The expression level of TLR4 mRNA on monoeytes and serum levels of TNF-α and SP-A levels observed to be positively correlated with each other in the 20 patients (P＜0.05). Conclusions The expression level of TLR4 mRNA on monoeytes and serum levels of TNF-α and SP-A levels may be associated with acute inflammation in sepsis induced ALI/ARDS patients.

Sepsis; Acute respiratory distress syndrome; Toll-like receptors 4; Tumor necrosis factor-α; Surfactant proteins-A

R459.7

B

1671-8194（2017）31-0001-02

常州市衛生計生委重大科技項目（ZD201505）；江蘇省“333工程”科研資助立項項目（BRA2016122）；常州市科技局基金資助（CJ20159022）

*通訊作者：E-mail:icuzb@qq.com