成人脂肪干細胞的體外多向分化能力觀察

段煉，黃柳明，劉鋼，封志純

(陸軍總醫院附屬八一兒童醫院，北京100700)

成人脂肪干細胞的體外多向分化能力觀察

段煉，黃柳明，劉鋼，封志純

(陸軍總醫院附屬八一兒童醫院，北京100700)

目的觀察成人脂肪干細胞(ADSCs)的體外多向分化能力。方法從正常成人脂肪組織分離得到ADSCs并體外培養。在ADSCs中分別加入成人脂肪、骨、軟骨、肝細胞的體外誘導培養基誘導，觀察誘導過程中細胞形態的變化，誘導前、誘導1周、誘導2周時采用RT-PCR法觀察細胞相應標志物mRNA表達的變化。結果ADSCs向脂肪細胞誘導2周，細胞內的脂質空泡聚集，小脂滴融合在一起并變大；最后細胞變為單房，并且充滿脂質，紅油O染色陽性；誘導1周細胞PPARγ、脂蛋白酶和αP2 mRNA表達較誘導前增加；誘導2周細胞PPARγ、脂蛋白酶mRNA表達降低，但αP2 mRNA變化不明顯。ADSCs向骨細胞誘導5天，細胞由成纖維形轉化為多邊形或不規則狀。誘導2周單層細胞聚集成塊，形成細胞島狀結構，ALP染色陽性，von Kossa染色可見黑色礦化結節；礦化結節形成后細胞向結節移行聚集，促使更多的細胞形成更大的礦化結節；誘導后細胞ALP、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原mRNA表達逐漸增加。ADSCs向軟骨細胞誘導1周，細胞呈多邊形或類圓形，細胞團向內呈放射狀聚集，FITC染色后免疫熒光可見Ⅱ型膠原；誘導1、2周時細胞Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖和SOX9 mRNA表達明顯高于誘導前。ADSCs向肝細胞誘導2周時可見部分細胞變成圓形或橢圓形，并隨時間順延呈肝細胞樣圓形細胞增多趨勢，細胞核居中，圓形且邊緣清楚，PAS染色陽性；誘導1、2周時細胞CK18、HNF1α及白蛋白mRNA表達明顯高于誘導前。結論成人脂肪組織中分離得到的成人ADSCs可在體外定向分化為脂肪細胞、骨細胞、成骨細胞和肝細胞。

成人脂肪干細胞；體外誘導；多向分化；脂肪細胞；骨細胞；軟骨細胞；肝細胞

干細胞具有強大的增殖能力和多向分化潛能，是組織工程的基礎。目前干細胞主要來源于各種組織，如肌肉、骨髓、臍血或胚胎等。相對于上述來源的干細胞，脂肪來源的干細胞由于其取材安全、簡單，在人體內儲量豐富，更少牽扯倫理、道德、法律方面的問題，并且同樣具有高增殖性和多向分化能力，在組織工程領域中的作用舉足輕重[1]。有研究證實，脂肪干細胞(ADSCs)被誘導后能表達成骨細胞、脂肪細胞等細胞基因和蛋白標志，即分化為成骨細胞、脂肪細胞等。但目前有關ADSCs分化能力的研究僅限于動物[2]。2013年9月～2016年9月，本研究觀察了成人ADSCs的體外多向分化能力?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 新鮮的正常人體腹部脂肪組織5 cm×5 cm×5 cm，取自一名年齡35歲的男性抽脂患者，患者已簽署知情同意書。成脂肪的體外誘導培養基(含10%FBS的DMEM培養基，1 μmol/L地塞米松，10 μmol/L胰島素，200 μmol/L消炎痛，0.5 μmol/L 3-異丁基-甲基黃嘌呤，1%抗生素以及谷氨酰胺)。成骨的體外誘導培養基(含10%FBS的DMEM培養基，0.1 μmol/L地塞米松，10 μmol/L β-磷酸甘油鈉，50 μmol/L維生素C，0.01 μmol/L 1，25-二羥維生素D3，1%抗生素)。成軟骨的體外誘導培養基(含10%FBS的DMEM培養基，10 ng/mL轉化生長因子β1，100 μmol/L地塞米松，6.25 μg/mL胰島素，50 μmol/L維生素C，110 μg/mL丙酮酸鈉，1%抗生素)。成肝細胞的體外誘導培養基(含10%FBS的DMEM培養基，20 ng/mL肝細胞生長因子，10 ng/mL基本成纖維細胞生長因子，4.9 μmol/L尼克酰胺，20 ng/mL制瘤素M，100 μmol/L胰島素，6.25 μg/mL轉鐵蛋白，3.6 μmol/L亞硒酸，190 μmol/L亞油酸，1%抗生素)。鼠抗人 CD29、CD44 和HLA-DR單克隆抗體購自美國BD 公司。RT-PCR逆轉錄試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，實驗所需引物由上海生工生物工程公司設計合成。

1.2 成人ADSCs分離及鑒定 將人脂肪組織剪碎移入0.075%膠原酶Ⅱ溶液中，37 ℃水浴30 min。將所得細胞懸液用細胞濾網過濾后以1×105/mL接種于6孔培養板，37 ℃、5%CO2、95%濕度條件下培養。每72 h換液(10%FBS的DMEM培養液)1次。貼壁細胞融合達90%后，0.25%胰蛋白酶消化傳代，按1×105/mL接種于6孔培養板，72 h換液1次。第3代細胞加入熒光標記的鼠抗人單克隆抗體CD29、CD44和HLA-DR孵育30 min后，使用流式細胞儀檢測，結果顯示CD29和CD44表達均為陽性，而HLA-DR不表達，證實為脂肪干細胞[3]。

1.3 ADSCs向脂肪細胞的誘導分化及鑒定 取生長狀態良好的第3代ADSCs細胞，消化制備成單細胞懸液，調整細胞密度為1×105/mL，接種于6孔培養板中，加入含10%FBS的DMEM培養液24 h，加入成脂肪的體外誘導培養基，每3天更換誘導培養基1次。每日取所得細胞制作爬片，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，60%異丙醇+1%紅油O密閉染色10 min，60%異丙醇分色，70%乙醇洗去多余染色劑，再用蒸餾水洗滌數次，光鏡下觀察細胞形態。分別于誘導前和誘導1、2周采用RT-PCR法檢測過氧化酶增殖激活受體γ(PPARγ)、脂蛋白酶和脂肪酸結合蛋白4(αP2)mRNA。操作按試劑盒說明書進行。以GAPDH為內參照，PCR引物電泳拍照觀察各標志物mRNA表達。

1.4 ADSCs向骨細胞的誘導分化及鑒定 誘導方法同1.3，誘導過程中加成骨的體外誘導培養基。每日取所得細胞制作爬片，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，緩沖液沖洗后行ALP染色和von Kossa染色，光鏡下觀察。分別于誘導前和誘導1、2周采用RT-PCR法檢測堿性磷酸酶(ALP)、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原mRNA。操作按試劑盒說明書進行。以GAPDH為內參照。PCR引物在1.5%瓊脂糖凝膠上行電泳。拍照觀察各標志物mRNA表達情況的變化。

1.5 ADSCs向軟骨細胞的誘導分化及鑒定 誘導方法同1.3，誘導過程中加成軟骨的體外誘導培養基。每日取所得細胞，4%多聚甲醛固定，PBS反復沖洗后使用鼠抗人Ⅱ型膠原染色，4 ℃過夜，PBS沖洗3次，使用羊抗鼠IgG-FITC染色1 h，PBS反復沖洗后使用免疫熒光顯微鏡觀察。分別于誘導前和誘導1、2周采用RT-PCR法檢測Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖和SOX9 mRNA。操作按試劑盒說明書進行。以GAPDH為內參照。PCR引物在1.5%瓊脂糖凝膠上行電泳。拍照觀察各標志物mRNA表達。

1.6 ADSCs向肝細胞的誘導分化及鑒定 誘導方法同1.3，誘導過程中加成軟骨的體外誘導培養基。每日取所得細胞制作爬片，室溫下4%多聚甲醛固定15 min，用過碘酸行PAS染色，光鏡下觀察。分別于誘導前和誘導1、2周采用RT-PCR法檢測CK18、肝細胞核因子1α(HNF1α)、白蛋白mRNA。以GAPDH為內參照。PCR引物在1.5%瓊脂糖凝膠上行電泳。拍照觀察各標志物mRNA表達。

2 結果

2.1 ADSCs向脂肪細胞的誘導分化結果 誘導24 h后可見細胞變圓，體積增大，胞內有少量脂滴形成，脂質空泡小并且大多位于細胞核旁。隨著誘導時間的延長，脂滴的數量和體積增加，ADSCs逐漸變為多房的脂肪細胞。誘導2周，細胞內的脂質空泡聚集，小脂滴融合在一起并變大；最后細胞變為單房，并且與成熟的脂肪細胞一樣充滿脂質。紅油O染色陽性。誘導前、誘導1周、誘導2周細胞PPARγ、脂蛋白酶和αP2 mRNA表達情況見圖1。誘導1周細胞PPARγ、脂蛋白酶和αP2 mRNA表達較誘導前增加；誘導2周細胞PPARγ、脂蛋白酶mRNA表達降低，但αP2 mRNA變化不明顯。見圖1A。

2.2 ADSCs向骨細胞的誘導分化結果 誘導5天細胞由成纖維形轉化為多邊形或不規則狀。2周后單層細胞聚集成塊，形成細胞島狀結構。ALP染色陽性，von Kossa染色可見黑色礦化結節。礦化結節形成后，細胞向結節移行聚集，促使更多的細胞形成更大的礦化結節。誘導后細胞ALP、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原mRNA表達逐漸增加。見圖1B。

2.3 ADSCs向軟骨細胞的誘導分化結果 誘導1周細胞呈多邊形或類圓形，細胞團向內呈放射狀聚集。FITC染色后免疫熒光可見Ⅱ型膠原。誘導1、2周細胞Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖和SOX9 mRNA表達明顯高于誘導前。見圖1C。

2.4 ADSCs向肝細胞的誘導分化結果 誘導2周可見部分細胞變成圓形或橢圓形，并隨時間順延呈肝細胞樣圓形細胞增多趨勢。細胞核居中，圓形且邊緣清楚。PAS染色陽性。誘導1、2周細胞CK18、HNF1α及白蛋白mRNA表達明顯高于誘導前。見圖1D。

注：A為脂肪細胞；B為骨細胞；C為軟骨細胞；D為肝細胞。

圖1ADSCs向脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肝細胞誘導前后相應標志物mRNA表達情況

3 討論

組織工程的目的在于修復受損的組織器官功能。保持充足的細胞供給和可變的細胞采集來源，是細胞治療的基礎。骨髓來源的間充質干細胞是成體干細胞生物學領域最重要的細胞來源，但其在分離培養過程中存在著諸多缺陷[4]。脂肪組織由胚胎間充質生成，相對于由造血細胞和間充質干細胞混合組成的骨髓干細胞而言，脂肪組織分離的干細胞具有更大的細胞同質性，在誘導過程中更能保證分化細胞的一致性，減少了細胞致畸、致瘤等可能；脂肪組織來源充足，獲取更容易，累及脂肪組織的疾病發病率很低[5]。因此，ADSCs應是一種比骨髓來源的間充質干細胞更理想的組織工程種子來源[6]。

研究發現，ADSCs的分離效率高于其他干細胞。有文獻選用NH4Cl裂解紅細胞[7]，這樣可能會影響分離得到的干細胞質量。本研究我們選擇使用細胞濾網去除消化后殘余的血管、紅細胞以及膠原纖維等雜質，大大減少了培養基中紅細胞和成纖維細胞的數量；同時選用0.075%Collagenase Ⅱ 37 ℃水浴30 min，節約了所用酶量和酶解時間。體外培養ADSCs的條件也較簡單，在加有任何批號FBS的DMEM培養基中均能很好地擴增；ADSCs平均倍增時間為60 h，并能穩定傳代10～15代。表明ADSCs體外細胞培養條件下呈高增殖率。ADSCs表達CD29和CD44，顯示其具有間充質干細胞的特性[8]；而其MHC Ⅱ相關蛋白HLA-DR不表達，說明它們極少表達與移植排斥相關的抗原分子，提示ADSCs具有免疫逃逸特性，可能進行同種異體移植。

ADSCs在成脂肪誘導過程中，顯微鏡下可觀察到細胞內脂滴聚集、融合并變大，能特異性將脂滴染成紅色的油紅O染色呈強陽性[9]；同時向脂肪細胞誘導后的細胞表達PPARγ、脂蛋白酶、αP2 mRNA，說明誘導后細胞已具有脂肪細胞特性。

成骨細胞的基本標志是能分泌ALP和鈣鹽[10]。本研究結果顯示，成骨誘導1～2周，可以觀察到礦化結節，細胞von Kossa染色呈陽性，證實分化細胞分泌鈣鹽并有鈣沉積；ALP染色陽性說明經成骨誘導后的ADSCs已具有成骨細胞特征。RT-PCR結果顯示，向骨細胞誘導后的細胞ALP、骨橋蛋白和I型膠原mRNA表達增加。骨橋蛋白是成骨作用的重要信號[11]，在誘導過程中的長時間表達可以證實成骨作用發生，誘導后的細胞已有骨細胞特性。

軟骨的網狀支架結構主要由Ⅱ型膠原構成，聚集蛋白聚糖在軟骨中起抗壓以及維持軟骨彈性的作用，Sox9則在軟骨生成中促進間充質細胞凝集[12～14]。本研究結果顯示，向軟骨誘導后的細胞分泌Ⅱ型膠原，RT-PCR結果顯示，誘導后細胞Ⅱ型膠原纖維、聚集蛋白聚糖和SOX9 mRNA表達增加，證實誘導后的細胞具有軟骨細胞特征。

本研究PAS染色結果證實，向肝細胞誘導的細胞糖原貯積，RT-PCR結果顯示ADSCs向肝細胞誘導2周后，CK18、HNF1α和白蛋白mRNA表達增加，說明誘導后的細胞已具有肝細胞功能。

綜上所述，成人脂肪組織能夠分離培養出ADSCs，其在體外具有多向分化的潛能，并且不具有免疫原性[15]?；谏鲜隼碛?，我們認為ADSCs可以成為干細胞的新來源，其在組織工程的臨床應用方面具有重要作用。

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國家自然科學基金資助項目(81500391)。

封志純(E-mail： zhjfengzc@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.011

R318

A

1002-266X(2017)40-0038-04

2016-10-10)