荔枝核總黃酮對大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖及PPAR-γ、TGF-β1表達的影響

張揚武，羅偉生，康毅，禤傳鳳，王仕衍，張夏，陳姍，蔡碧蓮

(1廣西國際壯醫醫院，南寧530001；2廣西中醫藥大學；3廣西中醫藥大學第一附屬醫院)

·基礎研究·

荔枝核總黃酮對大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖及PPAR-γ、TGF-β1表達的影響

張揚武1，羅偉生2，康毅3，禤傳鳳2，王仕衍2，張夏2，陳姍2，蔡碧蓮2

(1廣西國際壯醫醫院，南寧530001；2廣西中醫藥大學；3廣西中醫藥大學第一附屬醫院)

目的探討荔枝核總黃酮(TFL)對大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖及過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)、轉化生長因子β1(TGF-β1)表達的影響及其機制，為肝纖維化的臨床治療提供依據。方法將體外培養的HSC-T6細胞分為觀察1、2、3組和對照組。觀察1組加640 μg/mL的TFL，觀察2組加640 μg/mL的TFL和15 μmol/L的羅格列酮，觀察3組加640 μg/mL的TFL和2 μmol/L的GW9662，對照組加正常培養基。各組均繼續培養72 h。采用CCK-8法檢測各組細胞增殖情況(結果以OD450值表示)；采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞PPAR-γ、TGF-β1mRNA相對表達量；采用免疫組化SP法檢測各組細胞PPAR-γ、TGF-β1蛋白陽性表達率。結果培養72 h觀察1、2、3組OD450值均低于對照組(P均<0.05)，觀察2組OD450值低于觀察1組(P<0.05)，觀察3組OD450值高于觀察1組(P<0.05)。觀察1、2、3組PPAR-γ mRNA相對表達量和蛋白陽性表達率均高于對照組(P均<0.05)；TGF-β1mRNA相對表達量和蛋白陽性表達率均低于對照組(P均<0.05)；觀察2組PPAR-γ mRNA相對表達量和蛋白陽性表達率高于觀察1組(P<0.05)，TGF-β1mRNA相對表達量和蛋白陽性表達率低于觀察1組(P<0.05)；觀察3組PPAR-γ mRNA相對表達量和蛋白陽性表達率低于觀察1組(P<0.05)，TGF-β1mRNA相對表達量和蛋白陽性表達率高于觀察1組(P<0.05)。結論TFL能夠抑制大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖，該作用可能與其上調PPAR-γ表達、下調TGF-β1表達有關。

肝纖維化；荔枝核總黃酮；肝星狀細胞；過氧化物酶體增殖物激活受體γ；轉化生長因子β1；大鼠

荔枝核味甘、微苦，歸肝腎兩經，具有祛寒止痛、行氣散結的功效，荔枝核總黃酮(TFL)是荔枝核中藥理活性的主要成分之一。近年研究表明，TFL具有明顯的抗肝纖維化作用；TFL能夠上調過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)、下調結締組織生長因子的表達，逆轉肝纖維化[1]；TFL可通過上調PPAR-γ/c-Ski、下調α激動蛋白抑制肝星狀細胞的活化[2]。但其對PPAR-γ/TGF-β1信號通路有無交叉影響尚未可知。2016年1月～2017年2月，我們觀察了TFL對大鼠肝星狀細胞HSC-T6增殖及PPAR-γ、TGF-β1表達的影響，現分析結果并探討其機制，旨在為肝纖維化的臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 HSC-T6細胞購自中國科學院昆明動物研究所細胞庫。TFL購自南京澤郎醫藥科技有限公司，純度85%；羅格列酮、GW9662購自購自上海皓元生物醫藥科技有限公司；FBS、DMEM高糖培養基購自加拿大維森特公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、PPAR-γ、TGF-β1、GAPDH內參引物購自寶生物工程(大連)有限公司;PPAR-γ、TGF-β1一抗購自美國Abcam公司；兔免疫組化SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 細胞分組及干預 電子天平秤稱量20 mg TFL溶解于125 μL的DMSO中，加入完全培養基至25 mL，過濾配制成800 μg/mL的母液，然后用完全培養基稀釋成640 μg/mL的工作液[1]；用文獻[3，4]的方法制作羅格列酮工作液(濃度15 μmol/L)和GW9662工作液(濃度2 μmol/L)。取處于對數生長期的 HSC-T6細胞，胰酶消化后進行細胞計數，調整細胞密度為2×104/mL ,吹懸打勻后以每孔100 μL接種于96孔培養板。設觀察1、2、3組和對照組，每組5孔。細胞完全貼壁后棄去舊培養基，觀察1組加640 μg/mL的TFL，觀察2組加640 μg/mL的TFL和15 μmol/L的羅格列酮，觀察3組加640 μg/mL的TFL和2 μmol/L的GW9662，對照組加正常培養基。繼續培養72 h。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 組細胞增殖情況 采用CCK-8法。各組細胞培養72 h后棄培養基，加入新的完全培養基后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，置于37 ℃培養箱孵育1 h，多功能酶標讀數儀上測定450 nm處的OD值(OD450值)。

1.3.2 PPAR-γ、TGF-β1mRNA表達 采用實時熒光定量PCR法。培養72 h后用TRIzol法提取各組細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書行實時熒光定量PCR，以GAPDH為內參照。GAPDH上游引物5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAAC-3′，下游引物5′-GTGGTTCACACCCATCACAA-3′；PPAR-γ上游引物5′-CTGTTTTATGCTGTTATGGGT-3′，下游引物5′-GTCAAAGGAA-TGGGAGTGGTC-3′；TGF-β1上游引物5′-CTGGGGCCCTGCCCCTACAT-3′，下游引物5′-CTTGGGCTTGCG-ACCCACGT-3′。采用美國ABI 7300 PCR儀進行擴增，兩步法反應條件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s，44個循環。讀取Ct值，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。

1.3.3 PPAR-γ、TGF-β1蛋白表達 采用免疫組化SP 法。培養72 h 后取各組細胞用4%多聚甲醛固定，3% H2O2消除內源性過氧化氫酶，正常血清封閉后分別加入鼠抗人PPAR-γ、TGF-β1單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，隨后加入生物素二抗工作液及辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，經DAB 顯色，脫水、封片，光學顯微鏡下觀察。每組隨機選取9個有意義的高倍鏡視野進行觀察，可見細胞質呈特異性棕褐色陽性染色，計算每個視野下細胞中陽性細胞所占的百分數，即陽性表達率。

2 結果

2.1 各組細胞增殖情況比較 培養72 h時觀察1、2、3組和對照組OD450值分別為1.534± 0.016、1.318±0.006、1.846±0.017、2.244±0.084。觀察1、2、3組OD450值均低于對照組(P均<0.05)，觀察2組OD450值低于觀察1組(P<0.05)，觀察3組OD450值高于觀察1組(P<0.05)。

2.2 各組PPAR-γ、TGF-β1mRNA相對表達量比較 觀察1、2、3組PPAR-γ mRNA相對表達量均高于對照組(P均<0.05)，TGF-β1mRNA相對表達量均低于對照組(P均<0.05)。觀察2組PPAR-γ mRNA相對表達量高于觀察1組(P<0.05)，TGF-β1mRNA相對表達量低于觀察1組(P<0.05)。觀察3組PPAR-γ mRNA相對表達量低于觀察1組(P<0.05)，TGF-β1mRNA相對表達量高于觀察1組(P<0.05)。見表1。

2.3 各組PPAR-γ、TGF-β1蛋白陽性表達率比較 觀察1、2、3組PPAR-γ蛋白陽性表達率均高于對照組(P均<0.05)，TGF-β1蛋白陽性表達率均低于對照組(P均<0.05)。觀察2組PPAR-γ蛋白陽性表達率高于觀察1組(P<0.05)，TGF-β1蛋白陽性表達率低于觀察1組(P<0.05)。觀察3組PPAR-γ蛋白陽性表達率低于觀察1組(P<0.05)，TGF-β1蛋白陽性表達率高于觀察1組(P<0.05)。見表1。

表1 培養72 h后各組PPAR-γ、TGF-β1 mRNA相對表達量和蛋白陽性表達率比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與觀察1組比較，#P<0.05。

3 討論

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病轉化成肝硬化的必經階段。逆轉肝纖維化是阻斷肝臟疾病轉化成肝硬化的惟一方法[5]。肝纖維化的形成是由于肝星狀細胞(HSC)的激活從而導致大量的細胞外基質(ECM)沉積于肝內，而HSC激活的同時又可分泌大量的TGF-β1，這種自分泌的正反饋機制使TGF-β1加強儲脂細胞合成膠原，促進大量ECM合成，從而促進肝纖維化不斷進展[6]。研究證實，PPAR-γ通路可抑制HSC的活化而延緩肝纖維化進程；PPAR-γ可能是一種新的治療纖維化疾病的藥理學靶點[7]。PPAR-γ活性降低與HSC纖維母細胞樣活化關系密切，而給予活化的HSC多種內源或外源性PPAR-γ配體可顯著抑制HSC纖維生成活性[8]；PPAR-γ可通過阻斷TGF-β1信號通路抑制ECM的生成，從而抑制肝星狀細胞的活化和增殖[9]。PPAR-γ/TGF-β-Smad信號通路共同介導肝纖維化，姜黃素通過減少PPAR-γ的表達，從而減少ECM產生，PPAR-γ基因啟動子內有兩個Smad結合元件(SBEs)，Smad3/4蛋白復合物可特異性結合至SBEs，Smad4過度表達可消除姜黃素對PPAR-γ啟動子的負調節作用，減弱其對TGF-β信號通路的抑制作用[10]。

PPAR-γ作為一種核轉錄因子，對細胞的活化和增殖具有重要的調節作用。羅格列酮除了具有降糖作用外，還可以作為PPAR-γ的激動劑。研究發現，羅格列酮能夠通過上調PPAR-γ的表達從而抑制Ⅰ型膠原的表達，實現肝纖維化的逆轉[11]；羅格列酮干預后大鼠的肝纖維化程度減輕，PPAR-γ信號通路的變化與TGF-β1的表達存在某種關聯，PPAR-γ信號的激活可能通過TGF-β1途徑調節肝纖維化的進程[12]。GW9662是PPAR-γ選擇性不可逆拮抗劑。當羅格列酮激動PPAR-γ的表達時，HSC細胞的活化和增殖受到抑制，采用GW9662干預后，其PPAR-γ的表達受到抑制，抑制肝纖維化的作用減弱，從而證明GW9662可作為羅格列酮激動PPAR-γ表達的特異性阻斷劑[13～15]。

TFL是從荔枝核提取出來的一種化合物。研究證實，TFL有明顯的抗肝纖維化作用，涉及參與的信號通路主要有PPAR-γ、TGF-1、核轉錄因子-κB(NF-κB)、Toll樣受體(TLR)、血小板衍生生長因子(PDGF)等[1，2，16，17]。肝纖維化進程不是單一信號通路作用的結果，其中存在多個途徑的相互交叉和疊加，這一過程非常復雜。本研究結果顯示，TFL能抑制HSC-T6細胞的增殖，加入羅格列酮則HSC-T6細胞增殖活性進一步下降，加入GW9662則HSC-T6細胞增殖活性有所恢復。應用TFL聯合羅格列酮的觀察2組PPAR-γ mRNA相對表達量及蛋白陽性表達率高于單純應用TFL的觀察1組，TGF-1 mRNA相對表達量及蛋白陽性表達率低于單純應用TFL的觀察1組；而應用TFL聯合GW9662的觀察3組PPAR-γ mRNA相對表達量及蛋白陽性表達率低于單純應用TFL的觀察1組，TGF-1 mRNA相對表達量及蛋白陽性表達率高于單純應用TFL的觀察1組。提示TFL抑制HSC-T6細胞增殖的作用可能是通過上調PPAR-γ表達、下調TGF-1表達而實現的。激活PPAR-γ信號通路、進而抑制TGF-1表達可以抑制肝星狀細胞HSC-T6細胞的增殖，可能有助于逆轉肝纖維化。

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國家自然科學基金資助項目(81360530，81660779)；廣西中醫藥大學碩士研究生科研創新重點項目(YJS201617)。

羅偉生(E-mail: 4011188@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.008

R575

A

1002-266X(2017)40-0029-03

2016-10-27)