沉默P-REX2a對胃癌細胞SGC7901增殖、阿霉素敏感性的影響及其機制

周巧輝，艾耀偉，潘志紅，郭明文

(三峽大學人民醫院 宜昌市第一人民醫院，湖北宜昌443000)

沉默P-REX2a對胃癌細胞SGC7901增殖、阿霉素敏感性的影響及其機制

周巧輝，艾耀偉，潘志紅，郭明文

(三峽大學人民醫院 宜昌市第一人民醫院，湖北宜昌443000)

目的觀察沉默P-REX2a對胃癌細胞SGC7901增殖、阿霉素敏感性的影響，并探討其機制。方法將胃癌細胞SGC7901分為正常培養組(NM組)、陰性對照組(NC組)、干擾組(siRNA組)。NM組正常培養，NC組細胞轉染陰性對照序列，siRNA組轉染P-REX2a siRNA，轉染24 h時采用實時熒光定量PCR法檢測各組P-REX2a mRNA，轉染24、48、72 h時用MTT法觀察各組細胞增殖情況(以OD570表示)。另取胃癌細胞SGC7901同法分組并轉染48 h后加入0.3 μmol/L阿霉素培養24 h，用流式細胞術測算各組細胞凋亡率，用Western blotting法檢測各組Bcl-2、Bax、PTEN、Akt、p-Akt蛋白，用基于PIP3底物的定磷比色法測定PTEN磷酸酶活性。結果siRNA組P-REX2a mRNA低于NC組、NM組(P均<0.05)，轉染24、48、72 h時OD570高于NC組、NM組(P均<0.05)，加入阿霉素培養后細胞凋亡率高于NC組、NM組(P均<0.05)，Bax蛋白表達量、PTEN磷酸酶活性高于NC組、NM組(P均<0.05)，Bcl-2、p-Akt蛋白表達量低于NC組、NM組(P均<0.05)。三組PETN、Akt蛋白表達量相比P均>0.05。結論沉默P-REX2a可以抑制胃癌細胞SGC7901增殖，提高胃癌細胞SGC7901對阿霉素的敏感性。這可能是由于沉默P-REX2a可以提高PTEN磷酸酶活性、抑制PI3K/Akt通路活化、抑制Bcl-2表達、促進Bax表達進而促進細胞凋亡

胃癌；P-REX2a；基因沉默；小干擾RNA；阿霉素 ；第10號染色體同源缺失性張力蛋白

胃癌是人類四大惡性腫瘤之一，其病死率位于世界第二[1]。由于早期不易發現，就診時多已進入中晚期，因此胃癌的預后在較大程度上依賴于輔助化療。隨著分子機制不斷深入研究，多種有利的化療方案已在臨床實施或在探索中。傳統化療藥物在綜合化療中仍占主要地位，但逐年提高的耐藥率導致化療效率低下。因此，胃癌耐藥機制的探索成為當今研究的熱點。近年文獻[2～5]報道，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號通路在化療過程中被誘導激活從而導致腫瘤細胞的耐藥。PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，可以特異性使肌醇環上的3位羥基磷酸化，使4,5二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)轉變為第二信使3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，后者將蛋白激酶B(PKB，又稱Akt)轉移到細胞膜上，并改變Akt的構象使之能被3-磷脂酰肌醇依賴蛋白激酶1/2(PDK1/2)磷酸化和激活，從而傳遞抗凋亡信號[6]。第10號染色體同源缺失性張力蛋白(PTEN)具有脂質磷酸酶活性，可將膜PIP3的D3 位的磷酸而拮抗PI3K的活化效應[7]。P-REX2a蛋白具有DHPH結構域(與GEF的活性有關)，此結構域可直接與PTEN結合，從而抑制PTEN磷酸酶活性，促進PI3K/Akt的活化[8,9]。沉默P-REX2a應該對胃癌細胞的增殖和耐藥性產生影響，但是研究甚少。2014年5月～2016年2月，本研究采用siRNA技術沉默胃癌細胞SGC7901中P-REX2a的表達，并觀察胃癌細胞SGC7901增殖情況和阿霉素敏感性的變化，以及PTEN/PI3K/Akt調節軸的變化，探討通過沉默P-REX2a提高胃癌細胞化療敏感性的可行性及其機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 人胃腺癌細胞SGC7901購自上海賽百慷生物技術股份公司。DMEM細胞培養液購自Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，Lipofectamine2000和TRIzol購自Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒與SYBR Premix Ex Taq購自TaKaRa公司。一抗中P-REX2a(ab169027)購自Abcam公司，PTEN(9188P)、Akt(4691P)、p-Akt(S473，4060P)、Bax(2772S)、Bcl-2(2870P)均購自美國CST公司。MTT檢測試劑盒購自美國Sigma，阿霉素購自美國Selleckchem公司。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司。GENMED定磷比色法法測定試劑盒購自美國Genmed 公司。siRNA片段定制于由上海吉瑪公司，P-REX2a-Homo-883(siRNA)序列為5′-GGCAUCUA-CAGAUGGACAUTT-3′/5′-AUGUCCAUCUGUAGAU-GCCTT-3′。由上海吉瑪公司合成。

1.2 胃腺癌細胞SGC7901分組及siRNA轉染 人胃腺癌細胞SGC7901細胞貼壁生長，培養用含10%FBS的DMEM培養基培養，培養于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱，培養基中加入1%的雙抗(青霉素與鏈霉素)，隔天觀察、換液1次。取處于對數生長期、狀態良好的SGC7901細胞，以每孔2×105個接種于6孔板，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱。設正常培養組(NM組)、陰性對照組(NC組)、干擾組(siRNA組)。待細胞生長12 h后開始轉染，轉染前2 h，換為2 mL無血清DMEM培養基。按照Lipofectamine2000說明書操作，轉染時RNA與轉染試劑的比例為2∶1。

1.3 P-REX2a mRNA檢測 轉染24 h后收集各組細胞放入1.5 mL EP管中，加入1 mL TRIzol，按TRIzol試劑操作說明書逐步提取總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書操作，在PCR儀中合成cDNA。用cDNA行實時熒光定量PCR，參照試劑盒SYBR qPCR mix(TaKaRa)說明書操作，P-REX2a上游引物序列為5′-TGGGAGGGGTCCAACATCA -3′，下游引物序列為5′-TCTTCAACCGTCTGTGTTTTCTT-3′； GADPH上游引物序列為5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′，下游引物序列為5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s，然后95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s，共重復40個循環。采用2-ΔΔCt法計算P-REX2a mRNA相對表達量。實驗重復3次。

1.4 細胞增殖情況觀察 采用MTT法。轉染24、48、72 h后，每孔分別加入100 μL MTT，37 ℃培養4 h，吸出培養基，加入1 500 μL DMSO，震蕩10 min，各取100 μL放入96孔板中，酶標儀在570 nm處測定各孔吸光度值(OD)。每組設5個平行孔，各平行孔取均值，實驗重復3次。

1.5 細胞阿霉素敏感性觀察 另取胃癌細胞SGC7901同法分組并轉染48 h后加入終濃度為0.3 μmol/L的阿霉素繼續培養24 h。收集細胞，按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，加入500 μL Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL AnnexinV-FITC混勻，再加入5 μL 碘化丙啶混勻，室溫避光反應5～15 min，1 h內流式細胞儀測算細胞凋亡率。

1.6 細胞Bcl-2、Bax、PTEN、Akt、p-Akt蛋白檢測 采用Western blotting法。收集1.5中阿霉素處理后的細胞，加入100 μL的RIPA蛋白裂解液冰上裂解30 min，離心取上清，按BCA試劑盒操作說明測定蛋白濃度。用5%濃縮膠與10%分離膠進行SDS-PAGE，恒流轉膜，用含5%脫脂奶的TBST溶液室溫封閉1.5 h，加一抗4 ℃孵育過夜，取出用TBST洗10 min ，重復3次然后浸入相應二抗室溫孵育1 h，TBST液洗3次，化學發光法顯影。Image J 軟件測算條帶灰度值。以β-actin為內參，用目的蛋白條帶和β-actin條帶灰度值之比表示目的蛋白相對表達量。

1.7 細胞PTEN磷酸酶活性測定 收集1.5中阿霉素處理后的細胞，采用基于PIP3底物的定磷比色法檢測PTEN磷酸酶活性。參考GENMED定磷比色法法測定試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1 細胞P-REX2a mRNA表達比較 siRNA組、NC組、NM組細胞P-REX2a mRNA相對表達量分別為0.54±0.06、0.96±0.07、1。siRNA組P-REX2a mRNA相對表達量與NC組、NM組相比，P均<0.05。NC組細胞P-REX2a mRNA相對表達量與NM組相比P>0.05。

2.2 各組細胞增殖比較 轉染24、48、72 h各組細胞OD570見表1。轉染24、48、72 h時siRNA組細胞OD570高于NC組、NM組(P均<0.05)，NC組細胞OD570與NM組相比P均>0.05。

表1 轉染24、48、72 h各組細胞OD570比較

注：與NC、NM組相比，*P<0.05。

2.3 各組細胞凋亡率比較 siRNA組、NC組、NM組細胞凋亡率分別為(18.54±0.73)%、(17.37±0.33)%、(17.30±0.47)%。siRNA組細胞凋亡率與NC組、NM組相比，P均<0.05。NC組細胞凋亡率與NM組相比P>0.05。

2.4 各組細胞中Bcl-2、Bax、PTEN、Akt、p-Akt蛋白表達比較 各組細胞中Bcl-2、Bax、PTEN、Akt、p-Akt蛋白相對表達量見表2。三組細胞中PTEN、Akt蛋白相對表達量相比P均>0.05。siRNA組細胞Bax蛋白相對表達量高于NC組、NM組(P均<0.05)，Bcl-2、p-Akt蛋白相對表達量低于NC組、NM組(P均<0.05)。NC組細胞Bcl-2、Bax、p-Akt蛋白相對表達量與NM組相比P均>0.05。

表2 各組細胞Bcl-2、Bax、PTEN、Akt、p-Akt蛋白相對表達量比較

注：與NC、NM組相比，*P<0.05。

2.5 各組細胞PTEN磷酸酶活性比較 siRNA組、NC組、NM組細胞PTEN磷酸酶活性分別為0.41±0.01、0.30±0.08、0.29±0.06。siRNA組胞PTEN磷酸酶活性與NC組、NM組相比，P均<0.05。NC組細胞PTEN磷酸酶活性與NM組相比P>0.05。

3 討論

阿霉素是胃癌化療中的經典藥物，近些年被報道出現了耐藥。PI3K/Akt信號通路與胃癌阿霉素耐藥密切相關[2]。P-REX2a是一種Rac鳥苷酸交換蛋白，可與PTEN直接結合并使其喪失脂質磷酸酶活性，進而導致PIP3的蓄積。在PI3K/Akt信號通路中，PI3K的活化將PIP2 轉化為PIP3，PIP3作為第二信使可將Akt進行活化，最終導致細胞增殖分化[8]；而PTEN作為一個關鍵的負向調節因子，具有脂質磷酸酶活性，可將PIP3去磷酸化為PIP2[7]。研究發現，P-REX2a在包括胃癌在內的多種腫瘤中有高表達[8,10]，因此，P-REX2a的表達可能促進胃癌細胞增殖分化。由于95%以上的胃癌為胃腺癌，本次實驗我們選擇中分化的胃腺癌細胞SGC7901進行研究。本研究結果顯示，用siRNA沉默P-REX2a基因可以下調胃癌細胞SGC7901中P-REX2a mRNA并抑制細胞增殖，提示P-REX2a的表達促進胃癌的增殖分化。

PI3K/Akt信號通路在化療過程中常被激活而導致化療耐藥[2～5]。本課題組既往研究證實，在胃腺癌細胞SGC7901中，應用PI3K/Akt通路抑制劑與0.3 μmol/L阿霉素處理24 h時，可觀察到顯著的凋亡增加以及PI3K/Akt通路蛋白表達的改變[11]。另外，在胃癌細胞中上調PTEN后，可抑制PI3K/Akt通路的異常激活，從而逆轉胃癌阿霉素的耐藥[12]。因此，P-REX2a參與PTEN/ PI3K/Akt通路的調節，可能參與化療耐藥機制的調節。本研究結果顯示，用siRNA沉默P-REX2a基因后再加入0.3 μmol/L阿霉素處理24 h，細胞凋亡率較NC組、NM組明顯升高，與此同時凋亡相關蛋白Bax的表達升高，Bcl-2表達下降。這些結果表明P-REX2a可能通過調控Bcl-2、Bax表達影響細胞凋亡，進而參與胃癌細胞的阿霉素耐藥。

研究證實，在無PTEN表達的細胞中導入PTEN基因后可減少Akt的活化；若僅有P-REX2a的表達，Akt的活化水平基本不變，但同時高表達PTEN與P-REX2a時，則可檢測到Akt在S473與T308位點均被激活[8]。這表明P-REX2a調節PI3K/Akt通路依賴于PTEN。本研究結果顯示，與NC、NM組相比，siRNA組細胞PTEN、Akt蛋白表達基本不變，而PTEN脂質磷酸酶活性上升，p-Akt蛋白表達水平降低。提示在化療過程中沉默P-REX2a的表達可增強PTEN的脂質磷酸酶活性，降低Akt的活化，從而提升化療效果。

綜上所述，沉默P-REX2a可以抑制胃癌細胞SGC7901增殖，提高胃癌細胞SGC7901對阿霉素的敏感性。這可能是由于沉默P-REX2a可以提高PTEN磷酸酶活性、抑制PI3K/Akt通路活化、抑制Bcl-2表達、促進Bax表達進而促進細胞凋亡。未來我們可以通過抑制P-REX2a的表達或使其失活，在一定程度上提升阿霉素對胃癌的綜合化療效果。

[1] Ferlay J, Shin HR, Bray F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008[J]. Int J Cancer, 2010,127(12):2893-2917.

[2] 艾耀偉,于紅剛. PI3K/AKT/MDM2信號通路活化影響胃癌細胞對阿霉素敏感性的實驗研究[J].中華腫瘤雜志,2008,30(7):494-497.

[3] Fan QW, Weiss WA. Targeting the RTK-PI3K-mTOR axis in malignant glioma: overcoming resistance[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2010(347):279-296.

[4] Goler-Baron V, Sladkevich I, Assaraf YG. Inhibition of the PI3K-Akt signaling pathway disrupts ABCG2-rich extracellular vesicles and overcomes multidrug resistance in breast cancer cells[J]. Biochem Pharmacol, 2012,83(10):1340-1348.

[5] Zhang Y, Bao C, Mu Q, et al. Reversal of cisplatin resistance by inhibiting PI3K/Akt signal pathway in human lung cancer cells[J]. Neoplasma, 2016,63(3):362-370.

[6] Osaki M, Oshimura M, Ito H. PI3K/Akt pathway: its functions and alterations in human cancer[J]. Apoptosis, 2004,9(6):667-676.

[7] Chalhoub N, Baker SJ. PTEN and the PI3-Kinase Pathway in Cancer[J]. Annu Rev Pathol, 2009(4):127-150.

[8] Fine B, Hodakoski C, Koujak S, et al. Activation of the PI3K Pathway in Cancer Through Inhibition of PTEN by Exchange Factor P-REX2a[J]. Science, 2009,325(5945):1261-1265.

[9] Leslie NR. P-REX2a Driving Tumorigenesisby PTEN Inhibition[J]. Sci Signal， 2009,2(94):68.

[10] Guo B, Liu LY, Yao JY, et al. miR-338-3p suppresses progression of gastric cancer through PTEN-AKT signaling pathways by targeting P-REX2a[J]. Mol Cancer Res, 2014,12(3):313-321.

[11] Yu HG, Ai YW, Yu LL, et al. Phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway plays an important role in chemoresistance of gastric cancer cells against etoposide and doxorubicin induced cell death[J]. Int J Cancer, 2008,122(2):433-443.

[12] 付學瓊,于皆平，羅和生.PTEN的表達及其在阿霉素誘導胃癌細胞凋亡中的意義[J].中華內科雜志，2010,49(5):422-425.

EffectsofsilencingP-REX2aonproliferationandsensibilitytodoxorubicinofgastriccancercellsSGC7901

ZHOUQiaohui,AIYaowei,PANZhihong,GUOMingwen

(TheFirstPeople′sHospitalofYichang,ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang443000,China)

ObjectiveTo observe the effects of silencing P-REX2a on the proliferation and sensibility to doxorubicin of gastric cancer cells SGC7901 and to investigate its mechanism.MethodsSGC7901 cells were randomly divided into the normal group (NM group), negative control group (NC group), and interference group (siRNA group). The cells in the NM group were cultured as normal, the cells in the NC group were transfected with negative control sequences, and cells in the siRNA group were transfected with P-REX2a siRNA. We detected the mRNA of P-REX2a by real-time fluorescent quantitative PCR at 24 h after the transfection. MTT was used to observe cell proliferation in each group (OD570) at 24, 48, and 72 h after the transfection. Some other gastric cancer SGC7901 cells were divided into three groups as before, after 48-hour transfection, they were treated with 0.3 mol/L doxorubicin for 24 h, then we measured the apoptotic rate by using flow cytometry and detected the Bcl-2, Bax, phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 (PTEN), Akt, and p-Akt protein by using Western blotting. PTEN phosphatase activity detected by phosphorus PIP3 substrates-based colorimetric method.ResultsP-REX2a mRNA of the siRNA group was lower than that of NC group and NM group (P<0.05), but the OD570was higher than that of the NC group and NM group at 24, 48, and 72 h after the transfection (allP<0.05). After adding doxorubicin, the apoptosis rate was higher in the siRNA group than in the NC group and NM group (P<0.05); the Bax protein expression and phosphatase activity of PTEN was higher but the Bcl-2 and p-Akt protein expression was lower in the siRNA group than in the NC group and NM group (allP<0.05). No significant difference was found in the protein expression of PTEN and Akt between the three groups (bothP>0.05).ConclusionsSilencing P-REX2a can inhibit the proliferation and improve the sensitivity to adriamycin of gastric cancer SGC7901 cells. This may be due to that silencing P-REX2a can improve the phosphatase activity of PTEN, inhibit the activation of PI3K/Akt pathway and the expression of Bcl-2, promote the expression of Bax, and thus promote the apoptosis.

gastric carcinoma; P-REX2a; gene silencing; siRNA; doxorubicin; phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 (PTEN)

周巧輝(1989-)，女，碩士，醫師，主要研究方向：消化道腫瘤的發病機制及治療。E-mail： zqh19890902@163.com

艾耀偉(1971-)，男，博士，主任醫師，主要研究方向：消化道腫瘤的發病機制及治療。E-mail： aiyw2001@sohu.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.005

R735.2

A

1002-266X(2017)40-0018-04

2016-04-10)