miRNA-20a在膀胱癌中的表達及其機制研究*

陳玉錦 王劍松 顏汝平 柯昌興 丁明霞 欒婷 鄒仁超 王海峰

·臨床研究與應用·

miRNA-20a在膀胱癌中的表達及其機制研究*

陳玉錦①②王劍松①顏汝平①柯昌興①丁明霞①欒婷①鄒仁超①王海峰①

目的：探討miRNA-20a在膀胱癌組織中的表達及其機制。方法：收集2014年1月至2015年1月昆明醫科大學第二附屬醫院96例患者的組織標本，運用實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）方法檢測miRNA-20a在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達；生物信息學方法預測miRNA-20a的靶基因并采用雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證；qRT-PCR、Western blot以及細胞免疫熒光分別檢測人膀胱癌細胞系T24和J82細胞轉染miRNA-20a模擬物或陰性對照后對靶基因mRNA和蛋白表達的影響；CCK-8、Transwell侵襲小室和劃痕實驗檢測過表達miRNA-20a后T24細胞體外增殖、遷移和侵襲能力的改變。結果：miRNA-20a在膀胱癌組織中高表達，且與腫瘤的病理分級、臨床分期、轉移以及復發密切相關（P＜0.001）；雙熒光素酶報告基因實驗證實miRNA-20a與人源性長壽保障基因2（Homo sapiens longevity assurance homologue 2，LASS2）的3'-UTR直接靶向結合；轉染miRNA-20a模擬物可顯著下調膀胱癌細胞中LASS2 mRNA和蛋白的表達（P＜0.01），增強膀胱癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力（P＜0.01）。結論：miRNA-20a在膀胱癌組織中高表達，且miRNA-20a可通過靶向抑制LASS2促進膀胱癌細胞的增殖、侵襲和遷移，與膀胱癌的發生發展相關。

miRNA-20aLASS2 膀胱癌

microRNAs（miRNAs）是一類大小為19～25個堿基的非編碼內源性小RNA分子，通過與一個或多個靶基因3'-非翻譯區（untranslated region，UTR）結合調控靶基因的表達，從而在包括膀胱癌在內的多種腫瘤的發生發展過程中扮演著癌基因或抑癌基因的作用［1-2］。

為了探討miRNAs在膀胱癌中的表達及其可能的分子機制，本研究根據前期的研究結果［3］，篩選出miRNA-17-92基因家族中的miRNA-20a進一步研究，檢測miRNA-20a在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達，預測并驗證miRNA-20a的靶基因，觀察過表達miRNA-20a后膀胱癌細胞體外增殖、侵襲和遷移能力的改變，為膀胱癌的靶向治療和新的生物標志物的開發提供理論依據和新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 取自2014年1月至2015年1月昆明醫科大學第二附屬醫院96例行根治性膀胱切除術，且經病理學證實為膀胱移行細胞癌患者的癌組織及癌旁組織，年齡為（45.61±10.55）歲。所有的組織樣本采集后均立即置于液氮中保存。本研究獲得昆明醫科大學倫理委員會批準。

1.1.2 細胞株 人膀胱癌T24、J82細胞株購自中國細胞庫館藏中心。

1.1.3 主要試劑 Trizol試劑和LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；逆轉錄及熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）購自大連寶生物公司；胎牛血清、DMEM/F12培養液購自美國GIBCO公司；正常山羊血清購自北京中杉金橋生物技術有限公司；雙熒光素酶報告基因系統試劑盒購自美國Promega公司；miRNA-20a模擬物和陰性對照（miRNA-NC）購自廣州銳博公司；一抗（小鼠抗人LASS2蛋白多克隆抗體或小鼠抗β-actin單克隆抗體）、辣根過氧化物酶（HRP）或熒光素（FITC）標記的羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司；引物（miRNA-20a、U6、LASS2和GAPDH）由上海生工生物工程有限公司合成；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 人膀胱癌細胞系T24和J82細胞使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，37℃、5%CO2條件下常規培養。參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書分別進行膀胱癌T24和J82細胞miRNA-20a模擬物或miRNA-NC的轉染。

1.2.2 組織及細胞總RNA提取 Trizol法分別提取組織或細胞的總RNA后溶于30 μL的無RNA酶的DEPC水中，保存于-80℃冰箱中備用。

1.2.3qRT-PCR檢測 以U6為內參，按miRNA逆轉錄及熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）說明書操作，檢測組織中miRNA-20a的相對表達。逆轉錄條件為37℃60 min，85℃ 5 s；qRT-PCR反應條件為95℃ 30 s，95℃5 s、60℃20 s共40個循環。轉染48 h后收集T24和J82細胞提取RNA，以GAPDH作為內參基因，按mRNA逆轉錄及SYBR Green說明書操作，檢測miRNA-20a預測靶基因LASS2 mRNA的相對表達，反應條件為95℃2 min，95℃3 s、60℃30 s共40個循環。引物序列見表1。分別采用2-ΔΔCt法和2-ΔCt法對miRNA和mRNA的熒光定量PCR結果進行分析，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct參照基因，ΔΔCt=ΔCt癌組織-ΔCt癌旁組織。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4 生物信息學預測miRNA-20a的靶基因 利用Target Scan 7.1、miRNADB和miRNAMap數據庫預測miRNA-20a的靶基因。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因實驗 通過NCBI網站下載miRNA-20a的預測靶基因（LASS2基因）3'-UTR序列，由昆明江宗生物科技有限公司合成構建LASS2基因3'-UTR質粒pLUC-LASS2。取對數生長期的T24和J82細胞分別接種于48孔板，按LipofectamineTM2000說明書共轉染100 ng的pLUC-LASS2和終濃度為50 nmoL/L的miRNA-20a模擬物或miRNA-NC，48 h后采用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測熒光強度。

1.2.6 Western blot檢測 T24、J82細胞轉染48 h后，RIPA法提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白使用10%SDS-PAGE分離，濕轉法轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，滴加一抗4℃孵育過夜，與HRP標記的二抗室溫下孵育1 h后使用ECL發光試劑盒進行化學發光反應。實驗重復3次。

1.2.7 細胞免疫熒光檢測 將T24細胞接種在6孔培養板內的玻片上，次日轉染，48 h后使用4%多聚甲醛固定玻片上的細胞，依次以0.5%Triton X-100通透20 min、正常山羊血清封閉30 min，滴加一抗4℃孵育過夜，避光滴加FITC標記的二抗室溫下孵育1 h，DAPI復染核，洗滌、封片后置于熒光顯微鏡下觀察。實驗重復3次。

1.2.8 CCK-8實驗 將T24細胞鋪96孔板，次日轉染。分別于轉染前（0），轉染后24、48、72 h，將CCK-8溶液10 μL快速加入含有轉染細胞的板孔中，置于37℃、5%CO2培養箱內孵育2 h，測定490 nm處的吸光值（OD值）。實驗重復3次。

1.2.9 Transwell侵襲小室實驗 將T24細胞鋪6孔板，次日轉染，24 h后計數。按200 μL/孔將細胞（5×105/mL）懸液加入Transwell培養板上室；按500μL/孔將含10%FBS的完全培養基加入Transwell培養板下室，37℃、5%CO2條件下培養24 h取出、固定、染色，顯微鏡下隨機選取6個視野計數后取平均數。實驗重復3次。

1.2.10 劃痕實驗 將T24細胞鋪6孔板，次日轉染，24 h后使用20 μL的槍頭垂直于6孔板底部劃痕，使用PBS清洗直至顯微鏡下觀察痕線上無散在的細胞，37℃、5%CO2條件下培養24 h。分別在轉染后0、24 h取樣并拍照。采用Image J軟件計算劃痕面積。細胞遷移率=（T0劃痕面積-T24h劃痕面積）/T0劃痕面積×100%。實驗重復3次。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計量資料使用表示，采用t檢驗分析；計數資料采用χ2檢驗分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-20a在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達以及與臨床病理參數的關系

qRT-PCR檢測結果顯示，miRNA-20a在96例膀胱癌組織中的相對表達水平2.42±1.32明顯高于癌旁組織1.38±0.403，差異具有統計學意義（t=7.332，P＜0.001）。進一步分析發現，miRNA-20a相對表達水平與膀胱癌患者的病理分級、TNM分期、有無淋巴結轉移、有無遠處轉移以及是否復發密切相關（均P＜0.001），而與年齡、性別、腫瘤數目和腫瘤大小無關（均P＞0.05，表2）。

2.2 miRNA-20a靶基因的預測和驗證

生物信息學軟件的預測結果顯示，LASS2是miRNA-20a的靶基因（圖1）。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，共轉染含有LASS2基因3'-UTR的pLUCLASS2質粒和miRNA-20a模擬物后，T24和J82細胞熒光素酶活性均較轉染miRNA-NC明顯下降（P＜0.01，圖2），提示miRNA-20a與LASS2基因3'-UTR能直接靶向結合。

2.3 miRNA-20a對LASS2 mRNA和蛋白表達的影響

采用qRT-PCR、Western blot和細胞免疫熒光，檢測膀胱癌T24和J82細胞轉染miRNA-20a模擬物和miRNA-NC后LASS2 mRNA和蛋白的表達。結果顯示，與轉染miRNA-NC相比，兩株膀胱癌細胞轉染miRNA-20a模擬物后LASS2 mRNA和蛋白的表達均明顯降低（P＜0.01，圖3），提示miRNA-20a可抑制LASS2 mRNA和蛋白的表達。

2.4 miRNA-20a過表達對膀胱癌細胞的體外增殖、侵襲和遷移能力的影響

CCK-8、Transwell侵襲小室和劃痕實驗結果顯示，轉染miRNA-20a模擬物后，T24細胞的體外增殖、侵襲和遷移能力較轉染miRNA-NC均明顯增強（P＜0.01，圖4），提示miRNA-20a可促進膀胱癌細胞的體外增殖、侵襲和遷移能力。

表2 96例膀胱癌患者癌組織中miRNA-20a的表達與臨床病理參數的關系Table 2 Correlation between miRNA-20a expression and different clinical pathological parameters of 96 patients with bladder cancer

圖1 生物信息學預測LASS2為miRNA-20a的靶基因Figure 1 LASS2 is predicted as a target gene of miRNA-20a via bioinformatics analysis

圖2 miRNA-20a模擬物抑制熒光素酶活性Figure 2 MiRNA-20a mimics repress the luciferase activation

圖3 miRNA-20a模擬物抑制膀胱癌細胞LASS2 mRNA和蛋白的表達Figure 3 MiRNA-20a mimics repress the mRNA and protein expression of LASS2

圖4 miRNA-20a對膀胱癌細胞的增殖、侵襲和遷移影響Figure 4 MiRNA-20a promotes proliferation,invasion,and migration of bladder cancer T24 cells in vitro

3 討論

本研究結果顯示miRNA-20a在膀胱癌組織中的表達水平較癌旁組織明顯上調，且腫瘤分化程度低、臨床分期高、發生淋巴結或遠處轉移以及復發的膀胱癌組織中的miRNA-20a相對表達水平更高，提示miRNA-20a在膀胱癌組織中高表達且表達水平與腫瘤進展密切相關，與文獻報道［4-5］一致。

has-miRNA-20a定位于染色體13q31.3，由高度保守的miRNA-17-92基因簇編碼［6］，包含hsa-miRNA-20a-5p和hsa-miRNA-20a-3p兩種成熟序列。研究顯示，miRNA-20a可通過靶向CYLD［7］、TIMP-2［8］、ABL2［9］等基因促進多種腫瘤的發生發展，包括miRNA-20a在內的miRNA-17-92家族和E2F1、E2F2、E2F3為核心的反饋調控環路也已在淋巴瘤及膀胱癌等腫瘤中證實［10］。然而，有文獻報道，miRNA-20a可抑制胰腺癌、皮膚鱗狀上皮細胞癌等腫瘤的生長［11-12］。本研究推測miRNA-20a在不同腫瘤中的相反作用可能與miRNA-20a對不同腫瘤作用的特異性、腫瘤組織細胞類型的不同以及基因調控網絡的復雜性有關。

通過生物信息學和雙熒光素酶報告基因實驗，本研究首次證實了LASS2是miRNA-20a新的靶基因，轉染miRNA-20a模擬物能顯著抑制膀胱癌細胞中LASS2的表達，增強細胞的體外增殖、侵襲和遷移能力，提示miRNA-20a可能是通過直接靶向負調控LASS2的表達促進膀胱癌的發生發展。LASS2基因也稱為神經酰胺合成酶基因2（ceramide synthase 2，CERS2），定位于染色體1q11，已被證實在包括前列腺癌、肝癌在內的多種腫瘤中發揮著抑癌基因的作用［13］。本課題組的前期研究顯示［14-15］，LASS2在人膀胱癌組織中低表達、且表達量與患者的預后呈負相關；體外實驗也證實LASS2能明顯抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲。然而LASS2基因的靶向調控網絡目前尚不完全清楚。Wang等［2］研究發現，miRNA-9通過直接靶向LASS2基因的3'-UTR，抑制LASS2 mRNA和蛋白的表達，從而促進膀胱癌的增殖、侵襲和轉移。由此推測，miRNA-20a和miRNA-9通過與LASS2基因3'-UTR不同堿基序列的直接靶向結合，形成“多對一”的基因精細調控方式，抑制LASS2 mRNA和蛋白的表達，促進膀胱癌的增殖、侵襲和轉移。

綜上所述，miRNA-20a在膀胱癌組織中高表達，且與腫瘤進展有關的臨床病理參數密切相關。miRNA-20a可能是通過直接靶向抑制LASS2的表達，促進膀胱癌的增殖、侵襲和轉移，從而在膀胱癌的發生發展中起著類似癌基因的作用。

[1]Fan MQ,Huang CB,Gu Y,et al.Decrease expression of microRNA-20a promotes cancer cell proliferation and predicts poor survival of hepatocellular carcinoma[J].J Exp Clin Cancer Res,2013,32(1):21.

[2]Wang H,Zhang W,Zuo Y,et al.miR-9 promotes cell proliferation and inhibits apoptosis by targeting LASS2 in bladder cancer[J].Tumour Biol,2015,36(12):9631-9640.

[3]Liu J,Wang H,Wang Y,et al.Repression of the miR-93-enhanced sensitivity of bladder carcinoma to chemotherapy involves the regulation of LASS2[J].Onco Targets Ther,2016,9:1813-1822.

[4]Ren HL,Sun Y,Li SB,et al.Expression and correlation of E2F3,miR-17-5p and miR-20a in transitional cell carcinoma of bladder[J].Shandong MedicineJ,2011,51(20):23-25.[任海林,孫巖,李世斌,等.膀胱移行細胞癌E2F3、miR-17-5p、miR-20a的表達及相關性分析[J].山東醫藥,2011,51(20):23-25.]

[5]Yoshino H,Seki N,Itesako T,et al.Aberrant expression of microRNAs in bladder cancer[J].Nat Rev Urol,2013,10(7):396-404.

[6]WangY,ZhangY,WangH,etal.Aberrantlyup-regulatedmiR-20ainpreeclampsic placenta compromised the proliferative and invasive behaviors of trophoblast cells by targeting forkhead box protein A1[J].Int J Biol Sci,2014,10(9):973-982.

[7]Zhu M,Zhou X,Du Y,et al.miR-20a induces cisplatin resistance of a human gastric cancer cell line via targeting CYLD[J].Mol Med Rep,2016,14(2):1742-1750.

[8]Wang Z,Wang B,Shi Y,et al.Oncogenic miR-20a and miR-106a enhance the invasiveness of human glioma stem cells by directly targeting TIMP-2[J].Oncogene,2015,34(11):1407-1419.

[9]Qiang XF,Zhang ZW,Liu Q,et al.miR-20a promotes prostate cancer invasion and migration through targeting ABL2[J].J Cell Biochem,2014,115(7):1269-1276.

[10]Coller HA,Forman JJ,Legesse-Miller A.quot;Myc'ed messagesquot;:myc induces transcription of E2F1 while inhibiting its translation via a microRNA polycistron[J].PLoS Genet,2007,3(8):e146.

[11]Yan H,Wu J,Liu W,et al.MicroRNA-20a overexpression inhibited proliferation and metastasis of pancreatic carcinoma cells[J].Hum Gene Ther,2010,21(12):1723-1734.

[12]Zhou J,Liu R,Luo C,et al.MiR-20a inhibits cutaneous squamous cell carcinoma metastasis and proliferation by directly targeting LIMK1[J].Cancer Biol Ther,2014,15(10):1340-1349.

[13]Xu XY,Pei F,You JF.TMSG-1 and its roles in tumor biology[J].Chin J Cancer,2010,29(7):697-702.

[14]Wang H,Wang J,Zuo Y,et al.Expression and prognostic significance of a new tumor metastasis suppressor gene LASS2 in human bladder carcinoma[J].Med Oncol,2012,29(3):1921-1927.

[15]Zhao Q,Wang H,Yang M,et al.Expression of a tumor-associated gene,LASS2,in the human bladder carcinoma cell lines BIU-87,T24,EJ and EJ-M3[J].Exp Ther Med,2013,5(3):942-946.

（2017-04-10收稿）

（2017-07-24修回）

Expression and potential role of miRNA-20a in bladder cancer

Yujin CHEN1,2,Jiansong WANG1,Ruping YAN1,Changxing KE1,Mingxia DING1,Ting LUAN1,Renchao ZOU1,Haifeng WANG1

1Department of Urology,The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Yunnan Institute of Urology,Kunming 650101,China;2Department of Nephrology,New District Hospital of People's Hospital of Chuxiong Yi Autonomous Prefecture,Chuxiong 675000,China

Haifeng WANG;E-mail:highphone@126.com

Objective:To investigate microRNA-20a(miRNA-20a)expression in bladder cancer and its potential mechanism.Methods:MiRNA-20a expression was examined using quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR)in human bladder cancer tissues and the paired adjacent non-tumor bladder tissues of 96 patients.The target gene of the miRNA-20a was predicted and validated using bioinformatics analysis and reporter gene assay,respectively.The mRNA or protein expression of the target gene in bladder cancer T24 and J82 cells transfected with miRNA-20a mimic or negative control(NC)mimics was detected via qRT-PCR,Western blot analysis,and cell immunofluorescence.CCK-8,Transwell chamber,and wound-healing assays were applied to test the proliferation,migration,and invasion of T24 cells after miRNA-20a over-expression in vitro.Results:MiRNA-20a expression significantly increased in bladder cancer tissues compared with those in corresponding adjacent non-tumor tissues.High miRNA-20a expression in bladder cancer tissues was closely related to aggressive tumor phenotype,such as high histological grade,poor TNM stage,lymph node invasion,distant metastasis,and tumor recurrence(all P＜0.001).Dual-luciferase reporter assay confirmed that miRNA-20a can directly bind to the 3'-untranslated region(3'-UTR)of Homo sapiens longevity assurance homologue 2(LASS2).Transfection with miRNA-20a mimics significantly inhibited mRNA and protein expression of LASS2 in T24 and J82 cells(all P＜0.01)and promoted T24 cell proliferation,migration,and invasion in vitro.Conclusion:MiRNA-20a is highly expressed in bladder cancer tissues.MiRNA-20a enhances cell migration as well as proliferation and acts as an oncogene in bladder cancer because of the targeted inhibition of LASS2 expression.

:miRNA-20a,LASS2,bladder cancer

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.20.415

①昆明醫科大學第二附屬醫院泌尿外科，云南省泌尿外科研究所（昆明市650101）；②云南省楚雄州人民醫院新區腎臟內科

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81460384）、云南省科技計劃項目（編號：2015FB196）和云南省教育廳科學研究基金項目（編號：2014Z072）資助

王海峰 highphone@126.com

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81460384),Project of Yunnan Provincial Science and Technology(No.2015FB196),and Yunnan Provincial Department of Education Fund(No.2014Z072)

陳玉錦 專業方向為膀胱癌的臨床及基礎研究。E-mail：yncxcyj@sina.com