植入前遺傳學篩查中卵裂期與囊胚期胚胎染色體異常的比較

施文浩，張四林，王永博，師娟子

(西北婦女兒童醫院生殖中心，陜西 西安 710003)

植入前遺傳學篩查中卵裂期與囊胚期胚胎染色體異常的比較

施文浩，張四林，王永博，師娟子

(西北婦女兒童醫院生殖中心，陜西 西安 710003)

目的通過種植前遺傳學篩查患者的胚胎和染色體結果分析，比較卵裂期與囊胚期胚胎染色體數目異常。方法收集2015年1月1日至2017年4月30日西北婦女兒童醫院生殖中心行種植前遺傳學篩查(PGS)患者，胚胎培養至卵裂期和囊胚期活檢，PGS檢測采用array-CGH (BlueGnome 24SureV3)，比較卵裂期與囊胚期胚胎染色體的結果。結果PGS共活檢348枚胚胎，其中卵裂期67例，囊胚期281例，囊胚期胚胎的整倍體率高于卵裂期胚胎(43.68% vs 14.75%，Plt;0.01)，卵裂期胚胎中異常染色體的數目≥5條最為常見(42.31%)，而囊胚中異常染色體數目為1條最為常見(53.79%)。卵裂期胚胎中20,21,16,14號染色體發生率較高(gt;5.00%);8,4,12號染色體發生率較低(lt;3.00%)。囊胚中22,16,19,7,1,性染色體，21,15號染色體發生率較高(gt;5.00%)；10,17,12,3號染色體發生率較低(lt;3.00%)。在染色體缺失異常中，20，16，22，1，21號染色體發生率較高(8.14%，6.98%，6.98%，6.59%，5.81%,均gt;5.50%)；3號染色體缺失發生率低(0.78%)。染色體重復異常中19,16,22,21，性染色體，7,15,13號染色體發生率較高(gt;5.50%)；12號染色體缺失發生率最低(1.46%)。結論囊胚期胚胎的整倍體率高于卵裂期胚胎，卵裂期胚胎中異常染色體的數目≥5條最為常見，囊胚中異常染色體數目為1條最為常見。卵裂期胚胎中20,21,16,14號染色體發生率較高，而囊胚22,16,19,7,1,性染色體，21,15號染色體發生率較高。

植入前遺傳學篩查；卵裂期胚胎；囊胚；染色體異常；非整倍體

在自然生殖發育過程中，細胞分裂時期染色體不分離、減數分裂時期染色單體提早分離和染色體丟失引起染色體異常包括數量和結構異常，數量異常更為常見[1]。目前在胚胎種植前篩查的主要技術手段就是胚胎植入前遺傳學篩查或診斷(preimplantationgeneticscreening，PGS)，在胚胎植入著床之前，對早期胚胎進行染色體數目和結構異常的檢測，分析胚胎非整倍體風險的一種早期產前篩查方法，從而挑選正常的胚胎植入子宮，以期獲得正常的妊娠，提高患者的臨床妊娠率，降低流產率預防出生缺陷。PGS檢測可在卵裂期和囊胚期，已有較多文獻報道囊胚期比卵裂期顯出更多的優勢，如高整倍體率及低損傷低嵌合率等[2]，但是關于卵裂期和囊胚期胚胎各染色體異常的發生頻率及差異尚未充分的報道。胚胎發育過程不同階段染色體異常發生率對研究胚胎染色體與發育的關系非常重要，因此本文擬從PGS病例中研究卵裂期與囊胚期的檢測結果差異，分析卵裂期與囊胚期胚胎染色體數目異常的頻率和特點。

1資料與方法

1.1研究對象與分組

收集2015年1月1日至2017年4月30日在西北婦女兒童醫院生殖中心行PGS的常規體外受精—胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)患者，以其所檢測胚胎為研究對象。PGS檢測在西北婦女兒童醫院醫學遺傳中心完成，采用微陣列比較基因組雜交(array-comparative genomic hybridization,array-hGH)檢測。所有進入臨床PGS周期的患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1 IVF及胚胎活檢

采用常規的促排卵方案，當優勢卵泡中有1個直徑達到18mm(或者1/3個卵泡達18mm)注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)10 000IU，36～38h后經陰道超聲下取卵。取卵后4～6h常規卵胞漿內單精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，然后采用序貫培養(vitrolife G-series)胚胎至第3天或第6天[3]，活檢時間為受精后第3～6天，卵裂期胚胎在第3天進行卵裂球活檢，活檢1枚卵裂球送檢；囊胚在受精后第5天或第6天活檢，活檢部分外胚層細胞(10個左右)送檢。活檢后卵裂期胚胎或囊胚冷凍保存。

1.2.2 PGS檢測

活檢細胞采用單細胞基因組擴增，采用SurePlex DNA Amplification System 試劑盒進行全基因組擴增，然后通過array-CGH方法(BlueGnome 24SureV3 package kit)對擴增后的產物進行檢測，BlueFuse Multi軟件分析并出具報告。

1.3統計學分析

全部數據采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學處理，率的統計學檢驗采用χ2檢驗，等級資料率的檢驗采用秩和檢驗，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1基本數據

PGS共活檢348枚胚胎，其中整倍體胚胎數目為123(38.20%)，非整倍體胚胎數目為199(61.80%)，不同活檢時期(受精后第3～6天)活檢的PGS基本數據詳見表1。其中卵裂期與囊胚期的整倍體與非整倍體率比較差異有統計學意義(χ2=17.52,Plt;0.01)，見表1。

2.2異常染色體數目的發生頻率

卵裂期與囊胚期中單個胚胎異常染色體數目的發生率詳見表2，單個卵裂期胚胎中異常染色體的數目≥5條發生率最高(42.31%)，2條和3條染色體發生率低(3.85%，5.77%)；單個囊胚中異常染色體數目為1條的發生率最高(53.79%)，3條和4條染色體發生率低(10.34%，4.14%)。比較卵裂期與囊胚期的不同異常染色體數目發生率有顯著統計學差異(Z=-4.61，Plt;0.01)，見表2。

表1 不同活檢時期PGS基本數據(n)

注：D3～D6表示活檢時間為受精后第3～6天；嵌合體按非整倍體計算；*Plt;0.01(χ2=17.52)。

表2 不同活檢時期的單個胚胎異常染色體數目的發生頻率(n)

注：D3～D6表示活檢時間為受精后第3～6天；*Plt;0.01(Mann-WhitneyZ=-4.61)。

2.3卵裂期與囊胚期各染色體缺失/重復的發生頻率

2.3.1缺失/重復的發生率

卵裂期與囊胚期PGS中各染色體缺失/重復的發生頻率(見表3、圖1、圖2)。胚胎染色體缺失中20，16，22，1，21號染色體發生率較高(8.14%，6.98%，6.98%，6.59%，5.81%,均gt;5.50%)；3號染色體缺失發生率最低(0.78%)。胚胎染色體重復中19,16,22,21，性染色體，7,15,13號染色體發生率較高(gt;5.50%)；12號染色體缺失發生率最低(1.46%)，見表3。

表3 卵裂期與囊胚期PGS中各染色體缺失和(或)重復的發生頻率

圖1 PGS結果中各染色體缺失與重復的發生頻率

Fig. 1 Frequency of deletion and duplication of chromosomes in PGS results

2.3.2卵裂期與囊胚期不同染色體異常的發生頻率

卵裂期胚胎中20,21,16,14號染色體發生率較高(gt;5.00%)；8,4,12號染色體發生率較低(lt;3.00%)。囊胚中22,16,19,7,1,性染色體，21,15號染色體發生率較高(gt;5.00%)；10,17,12,3號染色體發生率較低(lt;3.00%)。

圖2 卵裂期與囊胚期PGS結果中的各染色體的異常頻率

3討論

3.1胚胎的非整倍體

非整倍體是最常見的染色體數目異常,發生于卵母細胞或胚胎可導致胚胎種植失敗、自發性流產和新生兒出生缺陷。據歐洲人類生殖與胚胎學會的10年PGS數據統計，共活檢89 373枚胚胎，僅有33%的胚胎染色體正常適合移植[4]，研究發現卵裂期胚胎染色體異常率為43.20%～70%[5-6]，囊胚期胚胎染色體異常率為39.10%[7]。文獻報道早期流產組織的異常率為54.7%～70.9%，以染色體數目異常最為常見，三體居多，如16-三體、15-三體、21-三體等[8-9]。然而關于卵裂期胚胎及囊胚的染色體異常特點卻鮮有報道。胚胎發育不同時期染色體異常的特點可能參與胚胎發育等生物學過程，因此，有必要對早期胚胎不同發育階段各染色體異常頻率進行研究。

3.2卵裂期與囊胚期染色體數目異常比較

本研究結果提示囊胚期胚胎的整倍體率高于卵裂期胚胎(Plt;0.001)，卵裂期胚胎中異常染色體的數目≥5條最為常見(42.31%),而囊胚中異常染色體數目為1條最為常見(53.79%)。卵裂期胚胎中20,21,16,14號染色體發生率較高(gt;5%)；8,4,12號染色體發生率較低(lt;3%)。囊胚中22,16,19,7,1,性染色體，21,15號染色體發生率較高(gt;5%)；10,17,12,3號染色體發生率較低(lt;3%)。在染色體缺失異常中，20，16，22，1，21號染色體發生率較高(均gt;5.50%)；3號染色體缺失發生率低(0.78%)。染色體重復異常中19,16,22,21，性染色體，7,15,13號染色體發生率較高(gt;5.50%)；12號染色體缺失發生率最低(1.46%)。由此可見，胚胎發育過程中，卵裂期與囊胚期胚胎染色體異常的頻率及種類存在差異。

胚胎染色體異常與胚胎發育關系密切[10]，有研究指出染色體異常可導致不同階段胚胎發育停滯，延長培養時間相對可獲得較高比例的正常胚胎[11]。染色體異常的胚胎可能在胚胎的某些特定階段發生發育阻滯，由此推測不同階段胚胎的染色體異常發生率可能存在差異。因此通過對不同發育階段的染色體異常發生率比較，可為胚胎染色體異常與胚胎發育的關系提供相關證據。

通過本研究PGS患者的染色體結果分析得出，囊胚期胚胎的整倍體率高于卵裂期胚胎，卵裂期胚胎中異常染色體的數目≥5條最為常見，囊胚中異常染色體數目為1條最為常見。卵裂期胚胎中20,21,16,14號染色體發生率較高，而囊胚22,16,19,7,1,性染色體，21,15號染色體發生率較高。卵裂期與囊胚期不同染色體發生的頻率和特點有差異。

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[專業責任編輯：童國慶]

Comparisonofchromosomalabnormalitiesincleavagestageandblastocyststageinpreimplantationgeneticscreening

SHI Wen-hao, ZHANG Si-lin, WANG Yong-bo, SHI Juan-zi

(ArtificialReproductiveCenter,NorthwestWomenandChildren’sHospital,ShaanxiXi’an710003,China)

ObjectiveTo compare the chromosomal abnormalities in cleavage and blastocyst stages by analyzing the chromosome results of patients undergoing preimplantation genetic screening.MethodsPatients undergoing preimplantation genetic screening (PGS) in reproductive center of Northwest Women and Children’s Hospital from January 1, 2015 to April 30, 2017 were collected, and embryo biopsy was carried out when embryo was cultured to cleavage and blastocyst stage. Array-comparative genomic hybridization (array-CGH) (Blue Gnome 24SureV3) was adopted for PGS. Embryo chromosome analyzing results in blastocyst and cleavage stages were compared.ResultsA total of 348 embryos were examined in PGS, including 67 embryos in cleavage stage and 281 in blastocyst stage. Aneuploidy rate of embryo in blastocyst stage was higher than that in cleavage stage (43.68% vs 14.75%,Plt;0.01). It was most common in embyos in cleavage stage that more than 5 chromosomes were abnormal (42.31%) while one abnormal chromosome in blastocysts was most common (53.79%). In embryos in cleavage stage, incidence of abnormality in chromosome 20, 21, 16 and 14 was high (gt;5.00%), while that in chromosome 8, 4 and 12 was low (lt;3.00%). Abnormal rate of sex chromosome 22, 16, 19, 7 and 1 and chromosome 21 and 15 was high in blastocysts (gt;5.00%), but abnormal rate of chromosome 10, 17, 12 and 3 was low (lt;3.00%). For chromosome deletion abnormalities, incidence of chromosome deletion in chromosome 20, 16, 22, 1 and 21 was high (8.14%, 6.98%, 6.98%, 6.59% and 5.81%, respectively, all above 5.50%), and incidence of chromosome deletion was low in chromosome 3 (0.78%). Incidence of chromosome duplication abnormality in sex chromosome 19, 16, 22 and 21 and chromosome 7, 15, 13 was high (gt;5.50%), and that in chromosome 12 was the lowest (1.46%).ConclusionAneuploidy rate of embryo in blastocyst stage is higher than that in cleavage stage. It is most common in embryos in cleavage stage that more than 5 chromosomes are abnormal, and one abnormal chromosome in blastocyst is most common. Incidence of abnormality in chromosome 20, 21, 16 and 14 is high in embryos in cleavage stage, while abnormality in sex chromosome 22, 16, 19, 7 and 1 and chromosome 21 and 15 is high in blastocyst.

preimplantation genetic screening (PGS); embryos in cleavage stage; blastocyst; chromosomal abnormalities; aneuploidy

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.11.017

R71

A

1673-5293(2017)11-1367-04

2017-07-11

施文浩(1985—)，男，主治醫師，碩士，主要從事生殖醫學的研究。

師娟子，主任醫師。