抗EGFR/VEGF雙特異性單鏈抗體的構建及其抗卵巢癌SKOV-3的研究

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(湖北文理學院附屬襄陽市中心醫院婦產科，湖北 襄陽 441000)

抗EGFR/VEGF雙特異性單鏈抗體的構建及其抗卵巢癌SKOV-3的研究

江紅，毛小剛

(湖北文理學院附屬襄陽市中心醫院婦產科，湖北襄陽441000)

目的將表皮生長因子受體(EGFR)和血管內皮生長因子(VEGF)同時進行靶向治療，可協同抑制作用，增強抗腫瘤效果。方法使用重疊聚合酶鏈式反應(PCR)手段，西妥昔單抗的可變區和貝伐珠單抗的可變區通過G4S柔性肽連接在一起，獲得同時靶向EGFR和VEGF的雙特異性單鏈抗體(scDb)；通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測scDb與EGFR和VEGF的結合活性，并計算親和力常數；流式細胞術檢測scDb對受體過表達的卵巢癌細胞系SKOV-3的結合能力； MTT法檢測scDb對卵巢癌細胞系SKOV-3的增殖抑制；Western Blot研究與單獨給藥相比scDb對SKOV-3相關信號通路的影響；建立卵巢癌SKOV-3細胞荷瘤小鼠動物模型，檢測scDb的體內抗腫瘤活性。結果通過重疊PCR手段和畢赤酵母X-33表達，成功獲得scDb，經Western blot鑒定驗證了scDb的分子量為55kD，證明表達及裝配正確。ELISA檢測scDb與EGFR和VEGF均有結合活性，通過EC50計算，得到scDb與EGFR的親和力常數為1.27nM，與VEGF的親和力常數為0.75nM。流式細胞術檢測scDb與SKOV-3的結合率為72.00%。MTT實驗，親本抗體組與雙特異性單鏈抗體組對SKOV-3均有抑制作用。通過Western blot實驗表明，scDb能同時阻斷EGFR和激酶結構域受體(KDR)的磷酸化，最終導致絲氨酸/蘇氨酸激酶等信號通路被強烈抑制。通過SKOV-3細胞裸鼠移植瘤模型的體內抗腫瘤實驗，scDb組在體內仍能發揮較強的抗腫瘤效果，高劑量組腫瘤抑制率可以達到(74.53±9.63)%。結論該文成功構建并表達了scDb。scDb具有良好的體內外抗腫瘤活性,為抗腫瘤治療提供了新的思路，有潛在的臨床應用前景。……