抗EGFR/VEGF雙特異性單鏈抗體的構建及其抗卵巢癌SKOV-3的研究

，

(湖北文理學院附屬襄陽市中心醫院婦產科，湖北 襄陽 441000)

抗EGFR/VEGF雙特異性單鏈抗體的構建及其抗卵巢癌SKOV-3的研究

江紅，毛小剛

(湖北文理學院附屬襄陽市中心醫院婦產科，湖北襄陽441000)

目的將表皮生長因子受體(EGFR)和血管內皮生長因子(VEGF)同時進行靶向治療，可協同抑制作用，增強抗腫瘤效果。方法使用重疊聚合酶鏈式反應(PCR)手段，西妥昔單抗的可變區和貝伐珠單抗的可變區通過G4S柔性肽連接在一起，獲得同時靶向EGFR和VEGF的雙特異性單鏈抗體(scDb)；通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測scDb與EGFR和VEGF的結合活性，并計算親和力常數；流式細胞術檢測scDb對受體過表達的卵巢癌細胞系SKOV-3的結合能力； MTT法檢測scDb對卵巢癌細胞系SKOV-3的增殖抑制；Western Blot研究與單獨給藥相比scDb對SKOV-3相關信號通路的影響；建立卵巢癌SKOV-3細胞荷瘤小鼠動物模型，檢測scDb的體內抗腫瘤活性。結果通過重疊PCR手段和畢赤酵母X-33表達，成功獲得scDb，經Western blot鑒定驗證了scDb的分子量為55kD，證明表達及裝配正確。ELISA檢測scDb與EGFR和VEGF均有結合活性，通過EC50計算，得到scDb與EGFR的親和力常數為1.27nM，與VEGF的親和力常數為0.75nM。流式細胞術檢測scDb與SKOV-3的結合率為72.00%。MTT實驗，親本抗體組與雙特異性單鏈抗體組對SKOV-3均有抑制作用。通過Western blot實驗表明，scDb能同時阻斷EGFR和激酶結構域受體(KDR)的磷酸化，最終導致絲氨酸/蘇氨酸激酶等信號通路被強烈抑制。通過SKOV-3細胞裸鼠移植瘤模型的體內抗腫瘤實驗，scDb組在體內仍能發揮較強的抗腫瘤效果，高劑量組腫瘤抑制率可以達到(74.53±9.63)%。結論該文成功構建并表達了scDb。scDb具有良好的體內外抗腫瘤活性,為抗腫瘤治療提供了新的思路，有潛在的臨床應用前景。

表皮生長因子受體；人類表皮生長因子；卵巢癌；雙特異性單鏈抗體

卵巢癌死亡率居于婦科惡性腫瘤的首位，如今對于卵巢癌的治療仍以手術和化療、 放療的聯合治療為主[1-2]。但較多的不良反應，較差的患者依從等問題仍然沒有得到很好的解決[3-5]。而近些年靶向藥物的發展改善了卵巢癌的治療效果，單克隆抗體通過與受體的結合激活下游信號通路或者下調受體表達，達到促腫瘤細胞凋亡的作用[6]。如今靶向血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的貝伐珠單抗(Bevacizumab)成為治療卵巢癌有效的手段[7-12]。研究發現表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號通路在卵巢癌的發展中扮演了重要的角色[12-14]，靶向EGFR的西妥昔單抗(Cetuximab)也作為治療卵巢癌的重要手段。EGFR與VEGF激活的血管內皮生長因子受體2都屬于酪氨酸激酶EGFR家族，在多種卵巢癌的發生發展過程中過度表達或激活[15]。有研究發現當長期使用單一種靶向的藥物時，在給藥一段時間后會產生耐藥性。而同時靶向VEGF和EGFR兩個靶點則可以抑制多條細胞信號傳導通路，降低耐藥性和不良反應，更好的抑制腫瘤的發生發展[16]。

基于這一理論本文提出一種同時靶向VEGF和EGFR雙特異性單鏈抗體(bispecific single-chain diabody，scDb)的研究方案[11, 17-19]。其相較于單克隆抗體含有兩種特異性抗原結合位點，在腫瘤細胞的不同靶點之間同時發揮效應功能，產生協同抑制的效果，解決了抗體單獨使用療效不佳且易產生耐藥性的問題[16]。并且雙特異性單鏈抗體相較于雙特異性抗體分子量更小，腫瘤組織滲透能力更強，免疫原性更低。為腫瘤的臨床治療提供新的方案和思路。

1材料與方法

1.1一般材料

Roswell Park Memorial Institute-1640(RPMI-1640)培養基購自美國Invitrogen公司；蛋白Marker購自上海伯樂生命醫學產品有限公司；鼠抗His抗體，FITC耦聯的羊抗鼠IgG-Fc單克隆抗體購自南京賽博生物公司；西妥昔單抗購自德國默克公司；貝伐珠單抗購自瑞士羅氏公司；胎牛血清FBS購自美國Invitrogen公司；Balb/c裸鼠購自揚州大學動物中心；細胞培養瓶及相關培養耗材購自美國熱電公司；TMB(Tetramethylbenzidine)顯色液購自上海碧云天公司；多種細胞因子購自美國PeproTech公司。

1.2方法

1.2.1 scDb表達及純化

通過DrugBank數據庫搜索西妥昔單抗和貝伐珠單抗的輕鏈與重鏈可變區蛋白序列(如表1)。使用G4S柔性肽將其連接在一起(見圖1A)[18]，并在C端引入6個組氨酸作為His標簽。雙特異性單鏈抗體序列經過畢赤酵母偏愛密碼子優化后送公司合成，并導入穿梭載體pPICZα中。采用畢赤酵母X-33表達系統，將菌種接種于 YPD 液體培養基(含終濃度 25μg/mL的博萊霉素)中 30℃活化培養 20～24h，搖床轉速為 220rpm；再將其1%接種量接于添加有 1×生物素溶液的 BMGY培養基中， 220rpm，30 ℃培養 20～24h；低溫3 000 rpm離心10min 收集 BMGY培養基中的菌體，將菌體重懸于等體積加有 1×生物素溶液的BMMY 培養基中，添加終濃度為 0.5%的甲醇， 30℃誘導發酵，每24h 補添加甲醇(終濃度 0.5%)進行誘導，連續誘導表達 5d。發酵液經硫酸銨沉淀法初步提取后采用鎳柱進一步分離純化得到電泳純蛋白，最后對利用Western Blot對純化得到的蛋白進行鑒定，以期獲得高產量高純度的雙特異性單鏈抗體。

表1 西妥昔單抗和貝伐珠單抗的輕鏈與重鏈可變區蛋白序列

1.2.2酶聯免疫吸附測定scDb的結合活性

采用酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)測定scDb的結合活性，先紫外線照射酶條30 min，使其活化。每孔加100μL 1μg/mL的EGFR或VEGF溶液， 4℃過夜包被。吸去抗原，每孔加200μL 磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次5min，拍干孔里溶液，加入 200μL脫脂牛奶封閉液，37 ℃孵育1h。棄封閉液，拍干，200μL PBS洗3次，每次5min，拍干。以碳酸鹽緩沖液梯度稀釋雙特異性單鏈抗體，加入100μL稀釋好的抗體，37 ℃孵育1h。棄上清，拍干，200μLPBS洗3次，每次5min，拍干。用封閉液稀釋抗His-HRP抗體，每孔加100μL，37℃孵育1h。吸去檢測性抗體，洗滌同上，拍干，每孔加100μL TMB 顯色液，室溫置于暗處孵育10～15min。每孔加50μL終止液，于多功能酶標儀測定OD450-OD630吸光度差值。

1.2.3流式細胞術測結合

制備SKOV-3單細胞懸液，細胞密度為在107個/mL。分為雙特異性單鏈抗體組和脫脂牛奶空白對照組。在每組中分別加入250μL相應的抗體或脫脂牛奶，抗體濃度為100nmol/mL，冰上孵育1h，洗滌，孵育鼠抗His抗體，洗滌，再孵育FITC-耦聯的羊抗鼠IgG抗體，洗滌，上機檢測。使用FlowJo 7.6.1對流式數據進行處理。

1.2.4 細胞增殖抑制實驗(MTT法)

制備SKOV-3單細胞懸液，鋪板，用培養基將細胞濃度調整至3×104個/mL，以100μL/孔接種于96孔細胞培養板，設置只有培養基不含細胞的空白對照組。用含2%FBS的相應培養基將西妥昔單抗或貝伐珠單抗以及等量雙特異性單鏈抗體以50μL/孔的量加入96孔板中，每個濃度設置3個復孔，37℃培養箱中靜置培養1h。按照每孔50μL的量加入含20ng/mLEGF和VEGF的2%FBS-1640培養基，使每孔中EGF和VEGF的終濃度均為10ng/mL；培養72小時后每孔加入11μL的5mg/mL的MTT溶液，37℃培養箱中繼續培養4h，棄上清，按每孔加入150μL DMSO后將 96 孔板放于微量振蕩器上振蕩10min。最后用酶標儀檢測570nm 處和630nm處的吸光值，將OD570-OD630作為每個孔的吸光值；抑制率按此計算公式：抑制率(%)= (對照組吸光值-實驗組吸光值)/對照組吸光值×100。

1.2.5 蛋白質印免疫跡法研究腫瘤細胞相關信號通路

收集培養瓶中培養的SKOV-3腫瘤細胞，用相應完全培養基調整細胞密度至2×105個/mL，按每孔2mL加入六孔板中，輕輕旋搖使細胞均勻分布在孔板中，置于5%CO2培養箱中37℃培養。待SKOV-3細胞培養至匯合度達到80%～90%時，PBS潤洗兩遍，每孔加入2mL無血清培養基，置于5%CO2培養箱中37℃培養12h。PBS潤洗兩遍，用含2%FBS的相應培養基稀釋西妥昔單抗、貝伐珠單抗和雙特異性單鏈抗體至100nM，按照每孔2mL的量加入上述孔板中，置于5%CO2培養箱中37℃培養1h。取出上述6孔板，每孔加入終濃度均為10ng/mL的VEGF和EGF，培養30min。收集上述各孔中的細胞至1.5mL的EP管中，用PBS洗滌兩次，每EP管中加入100μL細胞裂解液、1μL PMSF、 1μLCocktail (Ⅲ)、1μL NaF和1μLNa3VO4，將細胞重懸后置于4℃，裂解30min，每5min顛倒數次。冷凍離心機4℃， 2 000 rpm離心20min，用移液槍小心吸取離心上清液，轉移至干凈的EP管中，經Bradford蛋白測定試劑盒測定細胞總蛋白濃度。Western Blot實驗檢測EGFR、磷酸化EGFR、激酶結構域受體(kinase domain region receptor，KDR)、磷酸化KDR、AKT、磷酸化AKT和β-Actin。

1.2.6體內抗腫瘤活性檢測

制備SKOV-3單細胞懸液，細胞數在106個/mL，取200μL細胞懸液接種于裸鼠右側腋皮下，觀察移植瘤生長情況。并隨機分組，每組8只，共分為以下5組：陰性對照組(PBS組)，抗EGFR的西妥昔單抗組(10mg/kg)，抗VEGF的貝伐珠單抗組(10mg/kg)，同時靶向EGFR與VEGF的雙特異性單鏈抗體高劑量組(10mg/kg)，雙特異性單鏈抗體低劑量組(5mg/kg)。待瘤體積達到50～100mm3時開始尾靜脈給藥(記為day 1)，每兩天給一次藥并且對腫瘤體積進行測量，按以下公式計算瘤體積：V=LW2/2(其中V代表瘤體積，L代表腫瘤最長徑，W代表為腫瘤垂直方向的最大橫徑)，繪制腫瘤生長曲線。在第19天結束給藥，并計算各組體內腫瘤抑瘤率，抑瘤率=(對照組平均體積-實驗組平均體積)/對照組平均體積×100%。

1.3統計學方法

2結果

2.1獲得裝配正確的雙特異性單鏈抗體

西妥昔單抗和貝伐珠單抗的輕鏈與重鏈可變區蛋白序列，通過重疊聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術將其通過G4S柔性肽連接在一起，并在C端引入6個組氨酸作為His標簽(見圖1A)，導入穿梭載體pPICZα中，使用畢赤酵母X-33表達體系進行表達。經過硫酸銨沉淀法和鎳柱純化得到雙特異性單鏈抗體。如雙特異性單鏈抗體的示意圖(見圖1B)可以看出，雙特異性單鏈抗體具有同時靶向EGFR和VEGF的雙特異性。雙特異性單鏈抗體的分子量為55kD，Western Blot驗證(見圖1C)了雙特異性單鏈抗體裝配的正確性。獲得了純度較高且裝配正確的雙特異性單鏈抗體。

注： A為雙特異性單鏈抗體基因設計； B為雙特異性單鏈抗體結構示意圖；C為WB驗證抗體分子量；Lane1～4為純化的雙特異性單鏈抗體。

圖1雙特異性單鏈抗體的基因設計，結構示意圖及WB驗證

Fig. 1 Gene design, structural diagram and western blot of scDb

2.2 scDb與EGFR和VEGF有較好的結合活性

酶聯免疫吸附測定(ELISA)結果計算出雙特異性單鏈抗體與抗原的結合半數有效濃度(EC50)即親和力常數為，EC50越小，抗體與抗原的親和力越高。如圖2A，表1顯示：雙特異性單鏈抗體與EGFR的結合半數有效濃度(EC50)為190.51ng/L，即1.27nM。雙特異性單鏈抗體與VEGF的結合半數有效濃度(EC50)為112.02ng/L，即0.75nM。雙特異性單鏈抗體分別與EGFR和VEGF顯示出來較高的親和力，其親和力常數均達到了nM級，顯示了理想的親和力。

2.3 scDb能有效結合到卵巢癌細胞系SKOV-3表面

對使用脫脂牛奶作為一抗孵育的細胞作為陰性對照組，并進行設門，將對照組的FITC陽性閾值控制在1%以下，以這個門為基準再計算雙特異性單鏈抗體組的FITC陽性閾值，結果顯示：雙特異性單鏈抗體與A549細胞的結合率為72.00%(見圖2B)，母體單抗西妥昔的結合率為，表明制備的雙特異性抗體仍然保留有母體抗體的結合活性，并沒有因為抗體改造造成結合能力的降低。同時也從另一個方面明了腫瘤細胞模型模型選擇的正確性。

注：A為酶聯免疫吸附測定雙特異性單鏈抗體與EGFR及VEGF的親和力 ；B為雙特異性單鏈抗體，母體單抗西妥昔與SKOV-3細胞的結合。

圖2雙特異性單鏈抗體與EGFR及VEGF的親和力及其與SKOV-3細胞的結合

Fig.2 Affinities of scDb to EGFR and VEGF and the binding activities of scDb to SKOV-3

表2 酶聯免疫吸附測定雙特異性單鏈抗體與EGFR及VEGF的親和力

2.4 MTT法研究了scDb對SKOV-3細胞增殖抑制作用

實驗結果表明(見圖3、表3)，與PBS組對照相比，西妥昔單抗，貝伐珠單抗與雙特異性單鏈抗體均有抑制效果，且抑制作用呈濃度依賴性。在抗體濃度達到400nM時，雙特異性單鏈抗體抑制增殖率可以達到(65.75±3.64)%，明顯強于貝伐珠單抗組(43.16±2.52)%(t=3.562，P=0.007)和西妥昔單抗組(36.33±2.24)%(t=4.562，P=0.001)。通過MTT實驗可以進一步確定雙特異性單鏈抗體設計的優勢與效果。

圖3 MTT法檢測不同抗體對SKOV-3細胞增殖抑制作用

Fig 3. Inhibition of different antibodies to SKOV-3 proliferation detected by MTT

表3 MTT實驗檢測各組細胞抑制率

注：與雙特異性單鏈抗組比較，*Plt; 0.05，**Plt;0.01，***Plt;0.001。

2.5 scDb影響多種腫瘤細胞相關信號通路

EGFR和VEGF均參與AKT等信號通路的調控，而AKT信號通路與腫瘤的發生發展密切相關。本實驗通過Western Blot初步研究了聯合靶向EGFR和VEGF對腫瘤細胞相關信號通路的影響。結果顯示，由EGF激活的EGFR的磷酸化可被西妥昔單抗抑制，由VEGF刺激的KDR的磷酸化可被貝伐珠單抗抑制，而聯合給藥可同時抑制EGFR和VEGF的磷酸化(見圖4)。抑制EGFR 磷酸化或KDR磷酸化均可抑制AKT的磷酸化，當EGFR磷酸化(EGF刺激)和KDR磷酸化(VEGF刺激)被同時抑制時，AKT的磷酸化水平被降至更低。這一現象可以證明聯合給藥能降低EGFR/KDR的磷酸化，有效抑制EGFR/KDR的活化，降低控制細胞存活相關的Akt蛋白的表達激活。

注：Western Blot分析了在EGF和VEGF的刺激下雙特異性單鏈抗體對腫瘤細胞SKOV-3中EGFR、KDR、AKT磷酸化水平的影響，并與貝伐珠單抗和西妥昔單抗作比較。

圖4雙特異性單鏈抗體對腫瘤細胞SKOV-3相關信號通路的影響

Fig 4 Effects of scDb on signal transduction pathway of SKOV-3 cancer cell

2.6 scDb具有良好的體內活性

進一步研究scDb體內抗腫瘤活性。實驗結果表明(見圖5A、5B、表4)，單獨抑制EGFR或VEGF均能有效抑制腫瘤的生長，同時抑制EGFR和VEGF的作用效果更加明顯。雙特異性單鏈抗體能顯著抑制SKOV-3細胞裸鼠移植瘤的生長，其抗腫瘤作用效果呈現濃度依賴性，高濃度抗體給藥組的活性比低濃度給藥組強。在第19天給藥結束，通過瘤體積的測量，發現雙特異性單鏈抗體高劑量組在體內發揮較強的抗腫瘤效果，該給藥組的瘤體積明顯低于其他各組(見圖5A)。與PBS陰性對照組相比高劑量組腫瘤抑制率可以達到(74.53±9.63)%，明顯優于低劑量組(60.32±5.68)%(t=3.262，P=0.005)，親本貝伐珠單抗(49.45.±4.63)%(t=3.562，P=0.007)與西妥昔單抗組(37.46±6.62)%(t=3.062，P=0.004)(見圖5B、表4)。

表4 體內抗腫瘤實驗檢測各組腫瘤抑制率

注：與雙特異性單鏈抗-高劑量組比較，*Plt;0.05，**Plt;0.01，***Plt;0.001。

注：A為檢測不同給藥組19天內荷瘤裸鼠的瘤體積變化；B為根據第19天腫瘤體積計算不同抗體組的體內腫瘤抑制率。

圖5不同抗體對荷SKOV-3移植瘤裸鼠模型體內抗腫瘤實驗

Fig 5 In vivo assay of SKOV-3 cell xenografts in nude mice

3討論

3.1單一抗體治療卵巢癌的局限性

VEGF和EGFR都為卵巢癌研究的熱門靶點，與腫瘤的發生和發展有關。但是多種研究表明單獨抑制某一條通路，在卵巢癌治療前期有較好的效果，但一段時間過后治療效果逐步降低，并產生耐藥。耐藥的產生與腫瘤的代償機制有關，當抑制一條通路后另一條相關通路就會代償性的被激活，腫瘤繼續生長。臨床上會選擇聯合用藥的方案來同時抑制不同的信號通路，然而抗體聯合治療在臨床應用上受到很多局限，包括研發成本高、抗體產量低、上市申請法規繁瑣等，而且全長抗體分子量大，很難滲透入腫瘤組織發揮藥效。

3.2雙特異性單鏈抗體治療卵巢癌的優勢

基于此設計出雙特異性單鏈抗體，其有兩種特異性抗原結合位點，在腫瘤細胞的不同靶點之間同時發揮效應功能，產生協同抑制的效果，更好地發揮靶向抑制的功能。并且其相較于全長抗體的優勢在于其分子量較小和生產成本較低，并且擁有更好的體內外滲透性，故在抗腫瘤領域擁有較好的應用價值。

3.3雙特異性單鏈抗體在體內外均呈現良好抑瘤效果

本研究以雙靶向VEGF和EGFR的雙特異性單鏈抗體為研究對象，考察其在體內外抑制卵巢癌SKOV-3的活性，獲得增強的抗腫瘤功能，可以為雙靶向抑制VEGF和EGFR通路的卵巢癌治療策略以及新型抗卵巢癌藥物的開發提供一定的經驗和理論基礎。首先設計并表達雙特異性單鏈抗體，酶聯免疫吸附測定雙特異性單鏈抗體與EGFR和VEGF的結合活性，并計算出雙特異性單鏈抗體的親和力常數，都能達到nM級，顯示了理想的親和力。流式細胞結合實驗驗證了改造的抗體雙特異性單鏈抗體保留了親本抗體原有的卵巢癌細胞靶向性。細胞增殖抑制試驗驗證了雙特異性單鏈抗體較親本抗體更為有效的體外抗腫瘤活性。通過Western blot實驗初步研究了聯合給藥對腫瘤細胞相關信號通路，結果表明， 聯合給藥能同時阻斷EGFR和KDR的磷酸化，最終導致AKT等信號通路被抑制。EGFR/KDR的活化被抑制后，降低控制細胞存活相關的AKT蛋白的表達激活，這與腫瘤細胞的存活和增殖實驗結果相符。最后，利用SKOV-3細胞裸鼠移植瘤模型對雙特異性單鏈抗體的體內對其抗腫瘤活性進行研究，實驗表明相比于親本抗體雙特異性單鏈抗體可以顯著的抑制小鼠體內移植瘤的生長，抑制EGFR的磷酸化和腫瘤細胞的增殖。

綜上所述，雙特異性單鏈抗體雙靶向VEGF和EGFR信號通路，這種協同抑制可以有效的阻斷EGFR與KDR之間的竄擾(crosstalk)，對卵巢癌SKOV-3細胞的體內外抗腫瘤作用效果優于單靶向的親本抗體，可以為VEGF和EGFR信號通路聯合治療提供一種新的臨床治療的思路和經驗。

[1]Duda K,Cholewa H,abuzek K,etal. Novel strategies of ovarian cancer treatment[J]. Pol Merkur Lekarski,2015,39(233):337-342.

[2]Eftekhar M,Pourmasumi S,Karimi-Zarchi M. Preservation of ovarian function during chemotherapy and radiotherapy in young women with malignancies[J]. Iran J Reprod Med,2014,12(6):377-382.

[3]Martin Lluesma S,Wolfer A,Harari A,etal. Cancer vaccines in ovarian cancer: how can we improve?[J]. Biomedicines,2016,4(2):10.

[4]Tewari K S. Fifth annual workshop of cytoreductive surgery for advanced ovarian cancer and peritoneal surface malignancies[J]. Gynecol Oncol Res Pract,2016,3:10.

[5]蔡學勤,張立潔,馬歡,等. 腹腔熱灌注聯合靜脈化療治療晚期卵巢癌的療效及不良反應分析[J]. 中國婦幼健康研究,2017,28(S1):514-515.

[6]曹王麗,宋佳希,李芳秋. 單克隆抗體靶向治療卵巢癌研究進展[J]. 醫學研究生學報,2013,26(5):536-540.

[7]Shen W,Li H L,Liu L,etal. Expression levels of PTEN, HIF-1α, and VEGF as prognostic factors in ovarian cancer[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci,2017,21(11):2596-2603.

[8]Madsen C V,Steffensen K D,Olsen D A,etal.Serial measurements of serum PDGF-AA, PDGF-BB, FGF2, and VEGF in multiresistant ovarian cancer patients treated with bevacizumab[J].J Ovarian Res,2012,5(1):23.

[9]寧尼亞,劉松凡. VEGF與卵巢癌的研究進展[J]. 中國當代醫藥,2014,21(22):186-188.

[10]González-Palomares B, Coronado Martín P J, Maestro de Las Casas M L,etal. Vascular endothelial growth factor (VEGF) polymorphisms and serum VEGF levels in women with epithelial ovarian cancer, benign tumors, and healthy ovaries[J]. Int J Gynecol Cancer, 2017,27(6):1088-1095.

[11]Shen W, Li H L, Liu L,etal. Expression levels of PTEN, HIF-1α, and VEGF as prognostic factors in ovarian cancer[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2017, 21(11):2596-2603.

[12]Chen J,Ouyang J,Chen Q,etal. EGFR and CD44 dual-targeted multifunctional hyaluronic acid nanogels boost protein delivery to ovarian and breast cancers in vitro and in vivo[J]. ACS Appl Mater Interfaces,2017,9(28):24140-24147.

[13]張寶月,張俊農.表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑厄洛替尼聯合山奈酚誘導卵巢癌細胞凋亡的協同機制[J].吉林大學學報(醫學版),2016,42(1):31-35.

[14]Mehner C, Oberg A L, Goergen K M,etal. EGFR as a prognostic biomarker and therapeutic target in ovarian cancer: evaluation of patient cohort and literature review[J]. Genes Cancer, 2017, 8(5-6):589-599.

[15]Ranjbar R, Nejatollahi F, Nedaei Ahmadi A S,etal. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and epidermal growth factor receptor (EGFR) in patients with serous ovarian carcinoma and their clinical significance[J].Iran J Cancer Prev, 2015,8(4):e3428.

[16]Komatsu H, Oishi T, Itamochi H,etal.Serum vascular endothelial growth factor-A as a prognostic biomarker for epithelial ovarian cancer[J].Int J Gynecol Cancer,2017,27(7):1325-1332.

[17]羅微,溫茜,周明乾,等.抗人卵巢癌/抗人CD3單鏈雙特異性抗體介導的αβT細胞CDR3譜系漂移[J].南方醫科大學學報,2012,32(7):919-923.

[18]Larsen F O, Markussen A, Nielsen D,etal. Dual inhibition of EGFR and VEGF in heavily pretreated patients with metastatic colorectal cancer[J]. Oncology,2017,93(3):191-196.

[19]周雅瓊,張娟,金海珍,等.抗EGFR/抗KDR雙特異性單鏈抗體的構建及表達[J].藥學學報,2012,47(10):1317-1322.

[專業責任編輯：安瑞芳]

Constructionofbispecificsingle-chaindiabodyofanti-EGFR/VEGFandagainstovariancarcinomaSKOV-3

JIANG Hong, MAO Xiao-gang

(HubeiCollegeofArtsandSciencesAffiliatedCentralHospitalofXiangyang,HubeiXiangyang441000,China)

ObjectiveTo build a bispecific single-chain diabody (scDb) targeting epidermal growth factor receptor (EGFR) and vascular endothelial growth factor (VEGF) to enhance anti-tumor effect by synergistic inhibition.MethodsThe scDb targeting EGFR and VEGF was obtained by linking variable region of Cetuximab and Bevacizumab with G4S by means of PCR. ELISA was used to analyze the affinity of scDb to EGFR and VEGF, and affinity constant was calculated. The binding activity of scDb to SKOV-3 was detected by flow cytometry, and MTT assay was used to detect the inhibition of cell proliferation. Western Blot was used to research the effects of scDb on SKOV-3 signal transduction pathway. Finally, mouse tumor model was generated by endermic injecting SKOV-3 cells to detect the antitumor activity of scDb in vivo.ResultsThe scDb was purified with PCR and X-33 expression of pichia pastoris, and the Western blot results showed that scDb had a correct molecular weight of 55kD, proofing correct expression and assembly. ELISA revealed affinity of scDb to EGFR and VEGF, and the affinity constant was 1.27nM to EGFR and 0.75nM to VEGF. Binding ratio of scDb to SKOV-3 was 72.00% detected by flow cytometry. MTT assay showed that both parental antibody group and scDb group had inhibitory effect on SKOV-3. Western Blot analysis revealed that scDb could block phosphorylation of EGFR and kinase domain region receptor (KDR) and thus signal transduction pathway of serine and threonine kinase was strongly inhibited. In vivo assay of the SKOV-3 cell xenografts in nude mice showed that scDb played a stronger antitumor effect in vivo. Tumor inhibition rate of group with high dose reached 74.53±9.63%.ConclusionIn this study scDb is successfully established and expressed, which maintains good antitumor effect in vivo and vitro. A new thought is proposed with potential clinical application prospect.

epidermal growth factor receptor (EGFR); vascular endothelial growth factor (VEGF); ovarian carcinoma; bispecific single-chain diabody (scDb)

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.11.014

R711.7

A

1673-5293(2017)11-1357-05

2017-06-26

江 紅(1977—)，女，主治醫師，碩士研究生，主要從事婦科臨床工作。

毛小剛，副主任醫師。