葉酸缺乏對胚胎停育患者絨毛印記基因甲基化的影響

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(1.陸軍總醫院263臨床部婦產科，北京 101149；2.首都兒科研究所遺傳研究室，北京 100020)

[專題研究]

葉酸缺乏對胚胎停育患者絨毛印記基因甲基化的影響

趙琳琳1，盧曉琳2，劉鑫麗1，王理2，姚秀英1

(1.陸軍總醫院263臨床部婦產科，北京101149；2.首都兒科研究所遺傳研究室，北京100020)

目的探討葉酸缺乏對胚胎停育患者絨毛印記基因甲基化的影響。方法選取2015年4月至2017年4月在陸軍總醫院263臨床部婦科門診224例胚胎停育患者(研究組)以及同期同比例自愿來陸軍總醫院263臨床部人工流產孕婦(對照組)，按照是否葉酸缺乏分為葉酸正常亞組和葉酸缺乏亞組，分析不同組別胰島素生長因子2、父系表達基因3以及生長因子受體結合蛋白10甲基化狀態。結果對照組葉酸正常亞組IGF2、GRB10的甲基化指數均低于研究組葉酸缺乏亞組、葉酸正常亞組(t值分別為8.21、7.54、6.12、5.29，均Plt;0.05)。對照組與研究組IGF2、GRB10異常甲基化率比較，差異有統計學意義(χ2值分別為6.11、6.34，均Plt;0.05)。研究組組內葉酸缺乏亞組IGF2、GRB10異常甲基化率顯著高于葉酸正常亞組(χ2值分別為5.02、5.44，均Plt;0.05)；對照組葉酸正常亞組IGF2、GRB10異常甲基化率均顯著低于研究組葉酸缺乏亞組(χ2值分別為6.17、6.43，均Plt;0.05)。結論葉酸缺乏可能導致IGF2、PEG3基因甲基化程度以及異常甲基化率增高，從而引起胚胎停育。

胚胎停育；葉酸缺乏；絨毛組織；基因甲基化

胚胎停止發育是妊娠早期由于某種或者某些因素導致胚胎發育停止從而引起胚胎或者胎兒死亡。研究顯示，胎兒的生長發育狀態與母體的健康狀態密切相關[1]。近年來隨著工業交通等環境污染以及女性工作壓力不斷增加，胚胎停止發育的孕婦日益增加，給孕婦及家庭帶來了嚴重的生理、心理傷害，同時也增加了家庭的經濟負擔。葉酸缺乏與多種胚胎發育異常相關，如先天性心臟病、神經管畸形、唇腭裂以及DOWN綜合征等[2-3]。基因印記在早期胚胎發育過程中起著重要作用，印記基因甲基化異常與胎兒生長受限、自然流產有一定的相關性[4]。臨床上已經證實葉酸缺乏與胚胎停育有關，但是葉酸缺乏是否對早期胚胎發育過程中印記基因甲基化產生影響是研究的熱點，也是亟待解決的問題。本研究收集胚胎停育以及人工流產孕婦的絨毛組織，分析葉酸缺乏對胰島素生長因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)、父系表達基因3(paternally expressed gene 3，PEG3)以及生長因子受體結合蛋白10(growth factor receptor-bound protein 10，GRB10)的影響，以期為臨床早期診斷胚胎異常發育、胚胎停育等提供理論基礎。

1對象與方法

1.1研究對象

隨機選取2015年4月至2017年4月在陸軍總醫院263臨床部婦科門診就診的胚胎停育患者224例(研究組)，年齡23～35歲，平均年齡(29.17±3.42)歲，宮內孕6～10周，平均孕周為(8.26±1.34)周。根據美國超聲放射醫生協會提出的評估標準，B超診斷需要符合以下要求：頭臀長度在7mm及以上且無心跳；孕囊平均直徑在25mm且無胚胎；檢查出無卵黃囊的孕囊2周后不見有心跳的胚胎；檢查出有卵黃囊的孕囊11天后仍然未見有心跳。納入及排除標準：①研究對象身體健康，月經規律(月經周期為28～30d)，備孕及孕周內未服用葉酸；②既往未出現不良孕史，近期沒有服用過任何甾體類藥物，未放置宮內節育器，內分泌及激素水平經檢查正常；③夫妻雙方染色體檢查顯示正常；④排除生殖器官后天性缺失或者器質性病變；⑤排除自身免疫性疾病、子宮肌瘤、人工輔助技術妊娠者；⑥排除合并有心、肝、腦、腎功能疾病患者。研究組對象經B超檢查顯示：妊娠囊變性或者不增長、輪廓模糊、小于妊娠月份；胚芽枯萎縮小或者無心血管搏動，且1周復查仍然無改變。

選擇同期來本院因社會原因要求人工流產婦女224例(對照組)，年齡24～35歲，平均年齡(29.49±3.51)歲，宮內孕6～10周，平均孕周為(8.33±1.29)周。納入及排除標準：①正常妊娠婦女，身體健康，月經規律(月經周期為28～30d)，備孕期及孕周內未服用葉酸；②夫妻雙方染色體檢查顯示正常；③自愿要求人工流產；④研究對象知情同意；⑤既往未出現不良孕史，近期沒有服用過任何甾體類藥物，未放置宮內節育器，內分泌及激素水平經檢查正常；⑥排除生殖器官后天性缺失或者器質性病變；⑦排除自身免疫性疾病、子宮肌瘤、人工輔助技術妊娠者；排除合并有心、肝、腦、腎功能疾病患者；⑧婦科檢查時排除陰道炎、宮頸糜爛或者宮頸息肉等合并妊娠癥患者。研究組與對照組按照是否出現葉酸缺乏(lt;3μg/L)[5]分為葉酸正常亞組和葉酸缺乏亞組，所有研究對象的臨床資料見表2。

1.2血清葉酸檢測

所有受試對象均于妊娠組織娩出前1d清晨抽取肘靜脈血3mL，靜置半小時后采用高速離心機以3 500r/min離心20min，靜置后取上層血清并置于-80℃冰箱中保存備用，采用放射免疫試劑盒(美國MP Biomedicals LLC生物有限公司)測定血清中葉酸水平。

1.3絨毛組織標本收集及處理

所有研究對象均在妊娠組織娩出后，在較短時間內將大小為1cm3的絨毛組織取下，置于生理鹽水中沖洗，除去多余血塊等雜質，而后置于無菌培養皿中，于體視鏡下剪取絨毛組織，并置于1.5mL離心管內，將絨毛組織剪碎成直徑約1mm的組織塊，分裝于離心管內，放于-80℃冰箱中保存備用。待所有組織標本收集后，解凍組織標本，向離心管內加入600μL細胞核裂解液以及20μL蛋白酶K(20mg/mL)，55℃水浴3h，直到絨毛組織完全被消化。冷卻至室溫，向管內加入200μL蛋白沉淀液，渦旋振蕩30s，冰上放置5min，25 000r/min離心5min，取上清置于EP管中。向EP管中加入600μL異丙醇，輕輕顛倒混勻，至可見白色絮狀沉淀，采用20 000r/min室溫離心3min，棄去上清，在沉淀物種加入600μL乙醇進行洗滌，再次以20 000r/min室溫離心2min，棄去上清液，而后加入50μLTE緩沖液，置于4℃冰箱張過夜以溶解沉淀的DNA，將溶解的DNA置于-40℃冰箱中保存備用。

1.4甲基化特異PCR法檢測IGF2、GRB10、PEG3基因甲基化狀態

絨毛組織標本經DNA純化試劑盒純化，并采用Nanodrop-1000分光光度計測定DNA濃度，確定較為理想的純化濃度后，采用重亞硫酸鹽對基因組DNA進行轉化。將重亞硫酸鹽轉后的基因組DNA作為模板，采用熱啟動PCR擴增IGF2、GRB10、PEG3的印跡基因片段。PCE引物序列、產物大小見表1。引物合成由上海生工生物技術有限公司合成。甲基化特異PCR(methylation specific PCR, MSP)反應體系為25μL，其中含有2.5μL的10×緩沖液、1.5μL氯化鎂(濃度為25 mmol/L)、2μL的dNTP(濃度為2.5mmol/L)、PCR引物各1.25μL、DNA模板2μL，0.5μLTag DNA合成酶，剩余加上雙蒸水至25μL。擴增的條件為：IGF2及GRB10的條件是：95℃預變性3min，94 ℃變性30s，56℃退火40s，73℃延伸30s，共計39個循環，循環結束后73℃延伸10min；PEG3的擴增條件為：95℃預變性2min，94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共計30個循環，循環結束后72℃延伸5min。第2輪擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈系顯影，采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒純化凝膠，將純化后的片段與PMD18-T載體連接，轉化涂板后每一組絨毛組織標本挑去10個單一的陽性克隆送上海生工生物技術公司測序，每個實驗重復3次。甲基化狀態采用Labworks 圖像采集及分析處理軟件( 英國劍橋紫羅蘭科技有限公司) 對凝膠電泳圖片進行灰度掃描計算甲基化值(methylation index，MI)。

表1 基因IGF2、GRB10、PEG3引物序列

1.5統計學方法

2結果

2.1臨床資料比較

對照組與研究組在母親年齡、孕周以及孕前體質比方面差異無統計學意義(均Plt;0.05)，見表2。

表2 對照組與研究組臨床資料比較

2.2 IGF2、GRB10、PEG3經PCR擴增后電泳檢測結果

MSP法擴增印記基因IGF2、GRB10、PEG3的產物片段見圖1。每次MSP擴增均將純水作為空白對照，電泳檢測結果顯示空白對照組為出現假陽性的甲基化條帶或非甲基化條帶。研究結果顯示，在所有絨毛組織中均可以檢測到上述3個基因的甲基化條帶和非甲基化條帶，如圖1，提示絨毛組織中未發現完全的甲基化丟失或者非甲基化丟失。

2.3不同組別IGF2、GRB10、PEG3甲基化水平比較

研究結果顯示，對照組、研究組組內葉酸正常亞組IGF2、GRB10的MI均顯著低于葉酸缺乏亞組(t值分別為5.27、4.66、5.29、4.53，均Plt;0.05)。對照組葉酸正常亞組IGF2、GRB10的MI低于研究組葉酸缺乏亞組、葉酸正常亞組(t值分別為8.21、7.54、6.12、5.29，均Plt;0.05)，見表3。

圖1 GF2、GRB10、PEG3經PCR擴增后電泳圖

Fig.1 Electrophoresis of GF2, GRB10 and PEG3 amplified by PCR

表3 同組別IGF2、GRB10、PEG3甲基化水平比較

注：與研究組葉酸缺乏亞組比較，*Plt;0.05；與研究組葉酸正常組比較，#Plt;0.05；組內比較，▲Plt;0.05。

2.4不同組別IGF2、GRB10、PEG3異常甲基化率比較

研究結果顯示，對照組與研究組IGF2、GRB10異常甲基化率比較，差異有統計學意義(χ2值分別為6.11、6.34，均Plt;0.05)。研究組組內葉酸缺乏亞組IGF2、GRB10異常甲基化率顯著高于葉酸正常亞組(χ2值分別為5.02、5.44，均Plt;0.05)；對照組葉酸正常亞組IGF2、GRB10異常甲基化率均顯著低于研究組葉酸缺乏亞組(χ2值分別為6.17、6.43，均Plt;0.05)，見表4、圖2。

表4 不同組別IGF2、GRB10、PEG3異常甲基化率比較[n(%)]

(轉下表)

(續上表)

注：與研究組葉酸缺乏亞組比較，*Plt;0.05；組內比較，▲Plt;0.05。

注：A為IGF2；B為GRB10；C為PEG3，黑圓圈(●)表示離群值，星號(*)表示極端值，兩者均被認為是異常的甲基化值，縱坐標為甲基化值的百分數表示。

圖2 Boxplot分析IGF2、GRB10、PEG3甲基化值分布情況

Fig. 2 Boxplot analysis of methylation distribution of IGF2,GRB10 and PEG3

3討論

3.1葉酸與胚胎發育的關系

葉酸是人體必需的B族維生素，其在體內參與氨基酸的相互轉換、DNA的合成以及甲基化反應等機體內諸多重要的化學反應，在細胞的生長、分化、增殖以及修復的過程中起著重要作用。研究顯示，葉酸在胚胎發育早期出現的兩次表觀遺傳編程當中起著重要的作用[6]。各種原因導致葉酸攝入不足、吸收障礙以及利用代謝障礙等，都將會影響機體內葉酸水平，從而影響細胞內核酸的合成以及甲基化反應等。臨床已經證實，葉酸缺乏與多種胚胎發育異常相關，如先天性心臟病、神經管畸形、唇腭裂以及DOWN綜合征等。

3.2葉酸與印記基因甲基化的關系

囊胚期時，分化出的內細胞群以及滋養層開始不斷重新甲基化，從而建立胚胎與胎盤的DNA甲基化模式[7]。研究發現用富含維生素B12、葉酸等食物飼養孕雌鼠，其后代DNA甲基化水平顯著升高，證實胚胎發育早期葉酸對生殖細胞在內所有組織均有重要的調節作用[8]。DNA甲基化主要是通過修飾啟動子附件的印記控制區來調控等位基因的部隊稱表達，而這一修飾作用主要發生于胚胎發育早期，如葉酸以及維生素B12供應不足，將造成DNA甲基化紊亂，基因印記將無法得到精確的傳遞，最終導致胎兒生長以及發育缺陷。目前的流行病調查發現[9]。研究發現缺乏葉酸以及維生素的小鼠會出現印記丟失，給予正常飲食后這一作用仍不可逆轉[10]。目前臨床上已經發現，印記丟失與AS綜合征、臍疝-巨舌-巨人癥綜合征等疾病有關[11]。

3.3 IGF2、PEG3及GRB10基因甲基化與胚胎發育的關系

在胚胎期，滋養細胞較內細胞團對環境因素的干擾的敏感性更強，絨毛組織較胎兒更容易發生表觀遺傳修飾異常，這也是本研究選擇絨毛組織作為研究標本的原因。研究顯示，印記基因甲基化狀態異常可能與早期自然流產相關，且甲基化程度越高越易出現自然流產[12]。本研究納入了IGF2、PEG3及GRB10三種印記基因作為研究對象，觀察葉酸缺乏對上述三種印記基因甲基化的影響。IGF2也被稱為生長調節素A，是母源印記、父源表達的基因。研究顯示，IGF2編碼一種能夠促進胎兒胎盤生長的因子，而這一因子表達受阻則會導致胎盤胎兒生長受限[13]。在人類早期胎盤組織形成過程中，IGF2高表達于那些增殖最快的細胞內，如外滋養層細胞、胎兒血管內皮細胞等。PFG3基因位于人類染色體的19q13.4，動物研究證實PEG3敲除的小鼠生長發育受限，同時胎盤體積也明顯減小[14]。GRB10能夠編碼一種生長因子受體結合蛋白，而這一蛋白能夠與酪氨酸激酶受體相互作用，從而發揮調節作用。GRB10基因母本只表達于胎盤絨毛層中，其印記狀態在人類及小鼠的胎盤組織中保持著高度的保守性，研究發現，GRB10可以通過調節胰島素/IGF-1信號途徑參與胚胎發育[15]。通過本研究顯示，胚胎停育患者IGF2、PEG3甲基化率及甲基化指數均顯著高于人工流產組，提示IGF2、PEG3基因甲基化程度高(基因印記)與胚胎停止發育有關，其可能是IGF2、PEG3經甲基化后，不能編碼促進胎盤生長的因子，導致胎兒生長受限，引起胚胎發育停止。通過進一步研究顯示，胚胎停止發育組中葉酸缺乏亞組IGF2、PEG3甲基化率及甲基化指數最高，尤其是異常甲基化率顯著高于對照組，提示葉酸缺乏可能導致IGF2、PEG3甲基化異常，從而導致胚胎停止發育。本研究發現，研究組和對照組比較，無論葉酸是否缺乏，GRB10基因甲基化以及異常甲基化率均無顯著性差異，這可能與GRB10印記基因的高度保守性有關。

綜上，葉酸缺乏可能導致IGF2、PEG3基因甲基化程度及異常甲基化率增高，從而引起胚胎停育。

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[專業責任編輯：于學文]

Effectsoffolicaciddeficiencyonmethylationoffluffimprintinggeneinpatientswithembryonicincontinence

ZHAO Lin-lin1, LU Xiao-lin2, LIU Xin-li1, WANG Li2, YAO Xiu-ying1

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,ArmyGeneralHospital263DepartmentofClinical,Beijing101149,China;2.MolecularImmunologyofCapitalInstituteofPediatrics,Beijing100020,China)

ObjectiveTo investigate the effect of folate deficiency on methylation of fluff imprinting gene in patients with embryonic incontinence.Methods224 patients with embryonic incontinence (study group) and same proportion of patients with spontaneous abortion (control group) in Army General Hospital 263 Department of Clinical were randomly divided into normal subgroup of folic acid and folic acid deficiency subgroup. Methylation status of insulin growth factor 2 (IGF2), paternal expression gene 3 and growth factor receptor-bound protein 10 (GRB10) were analyzed in different groups.ResultsThe methylation index of IGF2 and GRB10 in the normal subgroup of the control group was lower than that in subgroups of study group (tvalue was 8.21, 7.54, 6.12 and 5.29, respectively, allPlt;0.05). Abnormal methylation rate of IGF2 and GRB10 between the control group and the study group was statistically significant (χ2value was 6.11 and 6.34, respectively, bothPlt;0.05). The abnormal methylation rate of IGF2 and GRB10 in folic acid deficiency subgroup was significantly higher than that in the normal subgroup (χ2value was 5.02 and 5.44, respectively, bothPlt;0.05). The methylation rate of IGF2 and GRB10 in the normal subgroup of the control group was significantly lower than that in folic acid deficiency subgroup of the study group (χ2value was 6.17 and 6.43, respectively, bothPlt;0.05).ConclusionFolic acid deficiency may lead to increase of the methylation degree of IGF2 and paternally expressed gene 3 (PEG3) and abnormal methylation rate, which might cause embryo incontinence.

embryo incontinence; folic acid deficiency; villi tissue; gene methylation

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.11.001

R5/R33

A

1673-5293(2017)11-1317-04

2017-07-07

國家自然科學基金資助項目(編號：81370967)

趙琳琳(1978—)，女，主治醫師，主要從事婦產科臨床工作。

劉鑫麗，副主任醫師。