糖痹康對糖尿病周圍神經病變大鼠坐骨神經PERK-Nrf2信號通路的影響*

穆曉紅，高 健，劉銅華，秦靈靈，孫 文，吳麗麗，李偉笠，鄧博文，李筱葉

(1.北京中醫藥大學東直門醫院，北京100700;2.對外經濟貿易大學，北京100023;3.北京中醫藥大學，北京100029)

糖痹康對糖尿病周圍神經病變大鼠坐骨神經PERK-Nrf2信號通路的影響*

穆曉紅1，高 健2，劉銅華3，秦靈靈3，孫 文3，吳麗麗3，李偉笠3，鄧博文3，李筱葉3

(1.北京中醫藥大學東直門醫院，北京100700;2.對外經濟貿易大學，北京100023;3.北京中醫藥大學，北京100029)

目的:觀察糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經中PERKNrf2信號通路的影響。方法:將雄性SD大鼠采用STZ法造模，成功后隨機分為模型對照組，彌可保組，糖痹康高、中、低劑量組，另選正常SD大鼠為正常對照組。彌可保組腹腔注射彌可保0.026 8g/(kg·d);糖痹康高、中、低劑量組依次灌胃糖痹康16.700，8.350，4.175 g/(kg·d)。所有藥物均以9 g/L生理鹽水配制，給藥量為0.01 mL/g體質量。模型對照組和正常對照組均予等量的生理鹽水灌胃，1 d 1次，連續16周。剖取大鼠坐骨神經，Western blot檢測坐骨神經中磷酸化的蛋白激酶樣內質網激酶(PERK)、轉錄因子NF-E2相關因子2(Nrf2);Real-time PCR檢測坐骨神經中血紅素加氧酶-1(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)mRNA 表達。結果:與正常對照組對比，模型對照組大鼠坐骨神經PERK、Nrf2蛋白表達顯著降低，HO-1、γ-GCS mRNA表達顯著降低，差別有統計學意義(P＜0.05)。與模型對照組對比，彌可保組和糖痹康高、中、低劑量組大鼠坐骨神經PERK、Nrf2蛋白表達顯著升高，HO-1、γ-GCS mRNA表達顯著升高，差別有統計學意義(P＜0.05)。結論:糖痹康通過上調PERK-Nrf2信號通路表達，發揮抗氧化作用，延緩糖尿病周圍神經病變進展。

糖痹康/藥效學;糖尿病周圍神經病變;磷酸化的蛋白激酶樣內質網激酶(p-PERK);轉錄因子NF-E2相關因子2(Nrf2);血紅素加氧酶-1(HO-1);γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS);動物;大鼠

糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病患者常見并發癥，常導致感覺神經、運動神經損傷，出現肢體麻木、疼痛、肌肉無力及萎縮等癥狀。研究發現，神經病變與氧化應激關系密切［1-3］，其中磷酸化的蛋白激酶樣內質網激酶(PERK)—轉錄因子NF-E2相關因子2(Nrf2)信號通路對高糖環境下活性氧的產生有抑制作用，能夠改善抗氧化應激損傷［4］，在DPN的防治中發揮重要作用。血紅素加氧酶-1(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)是PERK-Nrf2信號通路調節的抗氧化蛋白，同樣參與抗氧化應激作用［5］。糖痹康由黃芪、女貞子、桂枝、赤芍、黃芩、黃連、水蛭等組成，是在《金匱要略》黃芪桂枝五物湯基礎上根據臨床經驗加減化裁而成，已獲發明專利(專利申請號:200810167551.1)。前期研究［6-8］發現:糖痹康能夠改善DPN大鼠神經傳導速度、調節大鼠血清及坐骨神經中神經生長因子(nerve growth factor，NGF)含量和表達、抑制神經細胞凋亡等發揮抗氧化應激的作用。本研究建立DPN大鼠模型并以糖痹康進行干預，研究PERK-Nrf2及其下游基因 HO-1、γ-GCS的表達，以探討糖痹康對DPN的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級雄性健康SD大鼠80只，6～7周齡，體質量180～230 g，購自北京維通利華動物實驗中心，動物許可證號:SCXK(京)2006-0009。大鼠飼養于北京中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物實驗室，溫度(23±2)℃、濕度(55±10)%，12/12 h光照、黑暗循環，自由攝食、飲水。

1.2 藥品、試劑與儀器

糖痹康顆粒處方組成:黃芪、女貞子、桂枝、赤芍、黃芩、黃連、水蛭等，顆粒劑由北京中醫藥大學中藥學院提取、制備;彌可保(a-硫辛酸)，購自衛材藥業有限公司，批號141003;鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司產品，批號S0130;高脂飼料(基礎飼料65.75%、蔗糖20%、豬油10%、蛋黃粉3%、膽固醇1%、豬膽鹽0.25%)，北京科奧協力飼料有限公司產品;Trizol試劑盒，購自Life Technologies公司，批號98903;I抗 Nrf2 Rabbit mAb(貨號 12721)、Phospho-PERK Rabbit mAb(貨號3179)、Ⅱ抗Anti-rabbit IgG(H+L)(貨號14708)，均為 CST公司產品;THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix，日本 TOYOBO 公司產品，貨號QPS-201;ECL發光液，購自美國BIORAD公司，批號170-5060。E9032型酶標儀，美國Promega公司產品;Prism 7 500型PCR擴增儀，美國ABI公司產品;BX53型光學顯微鏡，日本Olympus公司產品;Mini-PROTEAN Tera System型垂直電泳儀、轉移槽，美國Bio-Rad公司產品;ChemiDocTM XRS+with Image LabTM Software凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司產品。

1.3 模型的建立、分組與給藥

將雄性SD大鼠適應性喂養1周，按體質量隨機取10只作為正常對照組，以普通飼料喂養;其余大鼠以高脂飼料喂養8周后，禁食不禁水過夜，次日腹腔注射STZ 45 μg/g造模，72 h后用血糖儀測尾尖血血糖，血糖水平持續≥16.7 mmol/L且穩定3 d者為造模成功［7］。將造模成功的大鼠按體質量、血糖隨機分為模型對照組，彌可保組，糖痹康高、中、低劑量組5組，每組10只。各組大鼠按體表面積法換算給藥劑量:彌可保組腹腔注射彌可保0.026 8 g/(kg·d);糖痹康高、中、低劑量組依次灌胃糖痹康16.700 0，8.350 0，4.175 0 g/(kg·d)。所有藥物均以 9 g/L生理鹽水配制，給藥量為0.01 mL/g體質量，模型對照組和正常對照組均予等量的生理鹽水灌胃，1 d 1次，連續16周。

1.4 檢測指標

連續給藥16周后，禁食不禁水12 h，根據大鼠體質量，按350 μg/g的劑量腹腔注射100 g/L水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，處死大鼠，迅速剖取大鼠兩側坐骨神經并以液氮凍存，待用。

1.4.1 大鼠坐骨神經中PERK、Nrf2蛋白表達

以Western blot測定。取凍存的大鼠坐骨神經，按RIPA試劑盒步驟提取總蛋白，加上樣緩沖液，100℃ 5 min 蛋白變性;上樣 20 μg/孔，10%SDSPAGE凝膠跑電泳，100V 2 h;半干法凝膠轉膜100 A 1 h;TBS溶液室溫洗膜15 min;Blocking one/Blocking one-P封閉30 min，I抗(1∶1 000稀釋)孵育，4℃ 過夜;洗膜后II抗(1∶10 000稀釋)孵育，室溫1 h;洗膜后，ECL發光液室溫反應1 min，凝膠成像系統成像，以Image J 7.0分析蛋白條帶。

1.4.2 坐骨神經中 HO-1、γGCS mRNA 表達

以Real-time PCR測定。取凍存的大鼠坐骨神經，Trizol提取總RNA;GoScriptTMReverse Transcription System試劑盒反轉錄，退火25℃ 5min，延伸42℃ 1 h，滅活 70℃ 15 min，得到 cDNA。配制20 μL反應體系:2 μL cDNA 稀釋液 +10 μL GoTaq反應液 +7.2 μL Nuclease-Free Water+0.8μL 引物混合，Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System擴增，條件:95℃ 10 min;95℃ 15 s，60℃1 min(共40次循環);95℃ 15s，60℃ 15 s溶解。結果采用2-△△CT相對定量法比較各組目標mRNA表達差異。引物見表1。

表1 引物

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠坐骨神經PERK、Nrf2蛋白表達對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠坐骨神經PERK、Nrf2蛋白表達顯著降低，差別有統計學意義(P＜0.05)。與模型對照組對比，各給藥組PERK、Nrf2蛋白表達顯著升高，差別有統計學意義(P＜0.05)。見表2、圖1。

表2 各組大鼠坐骨神經PERK、Nrf2蛋白表達對比n=10±s

表2 各組大鼠坐骨神經PERK、Nrf2蛋白表達對比n=10±s

注:與正常對照組對比，*P＜0.05;與模型對照組對比，#P＜0.05

分組 劑量/(g·kg－1·d －1)PERK/β-actin Nrf2/β-actin正常對照組 —0.86 ±0.13 0.80 ±0.04模型對照組 — 0.37±0.06* 0.28±0.11*彌可保組 0.026 8 0.82 ±0.17# 0.78 ±0.07#糖痹康高劑量組 16.700 0 0.94 ±0.10# 0.98 ±0.14#糖痹康中劑量組 8.350 0 0.76 ±0.07# 0.85 ±0.15#糖痹康低劑量組 4.175 0 0.70 ±0.12# 0.80 ±0.10#

圖1 各組大鼠坐骨神經PERK、Nrf2蛋白條帶

2.2 各組大鼠坐骨神經HO-1、γGCS mRNA表達對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠坐骨神經HO-1、γGCS mRNA表達顯著降低，差別有統計學意義(P＜0.05)。與模型對照組對比，各給藥組HO-1、γGCS mRNA表達顯著升高，差別有統計學意義(P ＜0.05)。結果見表3。

表3 各組大鼠坐骨神經HO-1、γGCS mRNA表達對比n=10，±s

表3 各組大鼠坐骨神經HO-1、γGCS mRNA表達對比n=10，±s

注:與正常對照組對比，*P＜0.05;與模型對照組對比，#P＜0.05

分組 劑量/(g·kg－1·d －1) HO-1 γGCS正常對照組 —0.96 ±0.06 0.98 ±0.02模型對照組 — 0.66±0.11* 0.72±0.15*彌可保組 0.026 8 1.01 ±0.10# 1.13 ±0.10#糖痹康高劑量組 16.700 0 1.45 ±0.17# 1.25 ±0.10#糖痹康中劑量組 8.350 0 1.17 ±0.13# 1.12 ±0.06#糖痹康低劑量組 4.175 0 1.13 ±0.08# 1.04 ±0.12#

3 討論

氧化應激是機體氧自由基生成和(或)消除能力之間的不平衡，出現活性氧簇(ROS)增加與抗氧化清除減弱，最終導致損傷組織細胞、蛋白的過程［9］。研究表明，高糖狀態下機體多條旁路代謝途徑激活，引起細胞內產生過多ROS，誘導氧化應激發生［10］。因此，氧化應激在在糖尿病發展中至關重要。據糖尿病并發癥的統一機制學說，DPN發病核心是高糖引起線粒體中ROS生成過多，引發組織細胞發生氧化應激，導致DNA損傷，引起周圍血管、神經病變，出現血流變異常，神經傳導速度減低以及病理改變等，最終導致 DPN［11］。

PERK作為內質網上跨膜蛋白之一，正常情況下發生磷酸化而被激活，激活后的PERK能夠激活Nrf2，活化后的Nrf2進入細胞核內與小Maf蛋白結合調控基因轉錄，包括 HO-1、γGCS［12－13］。PERKNrf2是重要的抗氧化應激通路，在延緩糖尿病及其并發癥的發展中發揮重要作用。研究表明，DPN患者存在氧化應激導致體內ROS產生過多，各種抗氧化物質如 HO-1、γGCS 等降低，抗氧化能力下降［14］。PERK-Nrf2信號通路激活可降低DPN患者ROS的產生，同時調控抗氧化基因HO-1、γGCS的轉錄，而HO-1、γGCS能夠啟動機體抗氧化系統，清除自由基起到保護細胞的作用［15－16］。本研究結果顯示:模型對照組大鼠坐骨神經內PERK、Nrf2蛋白表達與HO-1、γGCS mRNA表達均較正常大鼠顯著降低，而經過糖痹康治療后，此4個指標表達均顯著升高，表明糖痹康對PERK-Nrf2信號通路及其下游分子HO-1、γGCS的表達具有調控作用。

中醫學認為DPN屬于“痹癥”“痿證”等范疇，是氣陰兩虛基礎上導致久病入絡、脈絡瘀阻、氣血運行阻滯的過程，治療上應以益氣養陰、化瘀通絡為法［17］。糖痹康方中黃芪、女貞子益氣養陰，黃芩、黃連清熱解毒，赤芍、水蛭活血化瘀通絡，桂枝通脈。全方共奏益氣養陰清熱、化瘀通絡之效。本實驗結果提示:糖痹康通過調控調PERK-Nrf2信號通路及其下游分子HO-1、γGCS的表達而抵抗活躍氧化應激，從而改善神經細胞功能來狀態，進而起到了神經保護作用。

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R573.1

B

10.3969/j.issn.1001 －6910.2017.11.32

1001－6910(2017)11－0070－04

劉銅華，北京中醫藥大學，教授，thliu@vip.163.com

國家自然基金項目(81202970);教育部新世紀人才項目(NCET－12－0805)

2017－10－19;

2017－11－16(編輯 陶 珠)