缺氧誘導因子1調控創(chuàng)面微環(huán)境的分子機制研究進展*

陳 興，郝榮濤，葉 偉 綜述，周 汛審校

(重慶市中醫(yī)院皮膚美容科 400021)

缺氧誘導因子1調控創(chuàng)面微環(huán)境的分子機制研究進展*

陳 興，郝榮濤，葉 偉 綜述，周 汛△審校

(重慶市中醫(yī)院皮膚美容科 400021)

缺氧誘導因子1；創(chuàng)面微環(huán)境；分子機制；研究進展

隨著社會的發(fā)展和人口老齡化的加劇，創(chuàng)面尤其是難愈性創(chuàng)面問題已逐漸成為當今社會不容忽視的一大難題。難愈性創(chuàng)面增加患者經濟負擔，同時也加大社會醫(yī)療資源壓力，也嚴重影響了患者的生存質量。因此，對于創(chuàng)面的相關研究也顯得極其重要。

創(chuàng)面愈合是一個較為復雜的生物學過程，包括肉芽組織的形成和創(chuàng)面的再上皮化等基本步驟。在創(chuàng)面愈合過程中，由于創(chuàng)緣及肉芽組織中細胞高耗氧狀態(tài)，使創(chuàng)面形成一個低氧微環(huán)境[1]。有研究指出，慢性難愈性創(chuàng)面周圍的持續(xù)低氧環(huán)境是導致其延遲愈合的重要原因。同時，也有部分研究證實，短時低氧可促進血管的發(fā)生及創(chuàng)面的愈合[2]。但短時低氧促進創(chuàng)面愈合及長期低氧延遲創(chuàng)面愈合的具體分子機制目前均未闡明。當前有大量的研究從低氧環(huán)境下缺氧誘導因子1(HIF-1)的調控來研究低氧誘導的創(chuàng)面愈合分子機制。本文對當前HIF-1及其對創(chuàng)面調控的分子機制的研究進展進行綜述。

1 HIF-1組成及其活性在創(chuàng)面調控中的重要作用

HIF-1是由HIF-1α亞基與HIF-1β亞基共同組成的異二聚體轉錄因子，其中HIF-1α亞基主要存在于細胞質中，對氧分子及其敏感，而HIF-1β亞基主要存在于細胞核內，只有當HIF-1α亞基進入細胞核后與HIF-1β亞基共同作用才能發(fā)揮基因調控作用。由此也可以看出HIF-1的活性主要由HIF-1α亞基決定，這也是HIF-1α是目前HIF-1調控研究關鍵分子的原因所在。同時也可以看出HIF-1的活性調節(jié)主要體現在基因的轉錄水平和蛋白的表達水平上，例如在特殊情況下增加HIF-1α基因的轉錄來調控HIF-1的活性，同時也可以反作用調節(jié)HIF-1α蛋白的表達[3]。已有大量的研究顯示，在創(chuàng)面尤其是慢性創(chuàng)面的愈合過程中，由于其高氧耗極易造成缺氧環(huán)境，缺氧環(huán)境調控HIF-1對血管內皮生長因子(VEGF)等的表達也起到重要的調控作用[4]。VEGF又叫血管通透因子，是創(chuàng)面愈合過程中的一類重要調控蛋白，對創(chuàng)面及其周圍血管的生成起著重要的作用[5]，并以此促進創(chuàng)面愈合。除對VEGF的調控外，HIF-1還對創(chuàng)面細胞的增殖及遷移能力起著重要的調控作用。鑒于HIF-1在慢性難愈性創(chuàng)面周圍的持續(xù)低氧環(huán)境及短時低氧環(huán)境中的重要作用，HIF-1分子調控機制的探討對臨床創(chuàng)面的預防及治療均有著極其重要的意義。

2 創(chuàng)面微環(huán)境中HIF-1活性調控的分子機制

如前所述，HIF-1α亞基是HIF-1活性調控的關鍵組成成分，其對氧分子極其敏感，在不同的創(chuàng)面微環(huán)境中，其低氧狀態(tài)調控HIF-1 α亞基從而間接調控HIF-1的活性，并以此影響相關蛋白的表達。慢性創(chuàng)面中，由于組織細胞高耗能，使細胞微環(huán)境長期處于低氧狀態(tài)，此時胞質中HIF-1α亞基感受到低氧刺激并產生活性，隨后進入核內與靶基因中的HRE位點(缺氧反應元件)結合。HRE元件通常位于相關靶基因的啟動子區(qū)域，但也有部分報道指出位于增強子序列中，其核心的關鍵序列為5′-RCGTG-3′。HIF-1α與該序列結合后，調控下游靶基因的轉錄，進而調控創(chuàng)面表皮細胞的增殖遷移及創(chuàng)面相關生長因子的表達，并以此促進創(chuàng)面愈合[6]；此外，在急性創(chuàng)面中，細胞處于非低(缺)氧的狀態(tài)，此時HIF-1表達則受到PI3K/Akt/mTOR信號通路及MAPK通路的調控，無論是否缺氧機體均能通過MAKP途徑直接磷酸化，從而調控HIF-1的表達。

在急性創(chuàng)面的情況下，創(chuàng)面微環(huán)境還未處于低氧狀態(tài)，此時胞內的脯氨酸羥化酶(PHDs)促進HIF-1α亞基的羥基化，HIF-1α位點羥基化造成泛素化酶的結合，泛素化酶逐漸在細胞質中降解HIF-1α亞基，使其無法入核產生下游效應；而在慢性創(chuàng)面中，細胞微環(huán)境處于低氧或缺氧環(huán)境中，低氧或缺氧環(huán)境促使脯氨酸羥化酶失去活性，此時HIF-1α不被脯氨酸羥化酶羥基化，泛素化酶無法結合，使其產生活性，其后入核調控相關蛋白的表達產生效應，如通過上調脂蛋白受體LRP1影響熱休克蛋白HSP90α的表達，從而促進相關細胞的遷移調控創(chuàng)面愈合等[7]；也可以通過上調HIF-1α的表達后誘導表皮細胞整合素Integrin β1的表達，以此來促進細胞的遷移及創(chuàng)面愈合[8-9]。總的來看，HIF-1在急性創(chuàng)面及慢性創(chuàng)面中有著不同的分子調控方式。

2.1HIF-1在急性創(chuàng)面或早期創(chuàng)面中的活性調控 細胞通過激活一系列信號通路來應對低氧條件的生存，當前已知的大部分的通路均對HIF-1起到一定的調控，這些調控幾乎均依靠對HIF-1的穩(wěn)定性及轉錄活性來進行。在急性創(chuàng)面中，細胞微環(huán)境還暫時未處于低氧環(huán)境，該環(huán)境近似為常氧狀態(tài)，因HIF-1α亞基在急性創(chuàng)面中依舊存在，但由于常氧環(huán)境使其極易被羥基化然后被泛素化降解，通常具有不超過5 min的較短壽命，因此HIF-1α亞基在急性創(chuàng)面中也處于一個不斷降解與合成的動態(tài)過程。需要指出的是在急性創(chuàng)面微環(huán)境中，HIF-1α亞基的第402位脯氨酸殘基和第564位脯氨酸殘基被特異的脯氨酸羥化酶羥基化[10]，且此過程需要氧及亞鐵離子，及分別以α酮戊二酸及抗壞血酸鹽作為輔佐因子參與。這樣的催化方式也解釋了去鐵敏(desferrioxamine)及氯化鈷等研究工作中常用的模擬低氧或缺氧鐵離子拮抗劑或螯合劑等具有模擬低氧的效應[11]。

戊鄰酮二酸鹽是三羧酸循環(huán)的中間產物，該物質在激活PHDs中扮演著重要的作用，而三羧酸循環(huán)中其他產物如延胡索酸等與戊鄰酮二酸鹽起著拮抗的作用，抑制PHDs的激活[12]。當激活的PHDs與HIF-1α亞基作用后，HIF-1α亞基的第402位脯氨酸殘基和第564位脯氨酸殘基發(fā)生羥基化，VHL蛋白(Hippel-Lindau protein)識別此信息并與其結合。由于VHL蛋白為E3連接酶泛素化蛋白酶復合體重要組成成分，當HIF-1α亞基與VHL蛋白結合后引發(fā)VHL蛋白介導的HIF-1α亞基泛素化并逐漸降解[13]。此外，E3連接酶復合體中VHL還連接環(huán)指蛋白RBX1，RBX1與同源性的E2蛋白結合，此外VHL蛋白還與其他受體蛋白如延伸因子B(elongin B),延伸因子C(elongin C)及cullin 2等結合形成較大的蛋白復合體[14](圖1)。HIF-1α第803位天冬氨酸殘基在常氧條件下也容易被命名為FIH-1(factor-inhibiting-1)的天冬氨酸羥化酶羥基化，也阻礙輔助轉錄蛋白p300/CREB與HIF-1α碳端反式結合區(qū)域的結合[15](圖1)。

在上述過程中，FIH-1和PHDs蛋白相似，需要在戊鄰酮二酸鹽、鐵離子、抗壞血酸鹽及分子氧的共同作用下來促使羥基化，但和PHDs蛋白不同的是，FIH-1蛋白不會因三羧酸循環(huán)的中間產物如延胡索酸草酰琥珀酸等而受到抑制。因此，相比HIF-1α第402位脯氨酸殘基和第564位脯氨酸殘基而言，HIF-1α第803位天冬氨酸殘基更容易發(fā)生羥基化，影響其活性。HIF-1α亞基在經過上述過程后其活性受到抑制或者逐漸降解，使其無法入核與靶基因HRE元件結合，無法調控下游創(chuàng)面相關基因。因此，HIF-1在急性創(chuàng)面或早期創(chuàng)面的非低氧環(huán)境中起到的作用甚微。

急性創(chuàng)面或早期創(chuàng)面微環(huán)境還未處于低氧環(huán)境，此時HIF-1α第402位脯氨酸殘基(402P)及第564位脯氨酸殘基(564P)被特異性的PHDs羥基化。VHL蛋白識別HIF-1α脯氨酸殘基羥基化位點，并與其結合。VHL蛋白是E3連接酶復合體的重要組成部分，該連接酶復合體還包括elongin B、elongin C、cullin 2及Rbx1。E3連接酶復合體與具有泛素激活活性的E1及泛素連接活性的E2共同作用介導HIF-1α的泛素化，并且逐漸被蛋白酶體降解，以此無法進入細胞核內起調控作用。此外，HIF-1α第803位天冬酰胺殘基(803N)被FIH-1識別并羥基化，使其無法與p300/CBP蛋白結合，進一步降低HIF-1α的活性。

2.2HIF-1在慢性創(chuàng)面微環(huán)境中的活性調控 在慢性創(chuàng)面以及難愈性創(chuàng)面中，由于細胞一直處于高耗氧，因此其微環(huán)境為低氧或缺氧狀態(tài)，在此時，具有調控HIF-1α亞基羥基化的PHDs及FIH-1在氧分子的作用下均失去活性，HIF-1α亞基的脯氨酸殘基均不再發(fā)生羥基化，因此HIF-1α也不再發(fā)生泛素化降解并在細胞中逐漸累積。當積累到一定程度后，HIF-1α亞基進入細胞核并與HIF-1β形成二聚體結合到相關靶基因的HRE序列(5′-RCGTG-3′五核苷酸序列)上，以此調控細胞遷移、增殖及促進創(chuàng)面愈合的基因表達，促使細胞在低氧狀態(tài)下生存[16]。此外，在低氧微環(huán)境中，p300/CBP蛋白也與HIF-1α相互作用，并抑制HIF-1α亞基第803位天冬氨酸殘基的羥基化，以此來增加HIF-1的轉錄活性[17]。在慢性創(chuàng)面的低氧或缺氧條件下，HIF-1直接或間接調控的基因超過100個，涉及細胞的增殖、分化、遷移及凋亡等[17]。目前研究比較清楚的HIF-1的靶標基因VEGF，對血管的生成具有重要作用，同時也有利于創(chuàng)面的愈合[2](圖2)。此外，在眾多受HIF-1調控的蛋白中，CXCR4與SDF-1在調控細胞黏附、遷移及在血管的形成中具有極其重要的作用[18](圖2)。

圖2 慢性創(chuàng)面微環(huán)境中HIF-1α調控模式圖

在慢性創(chuàng)面微環(huán)境的低氧或缺氧條件下，因PHDs及FIH-1在氧的作用下蛋白失活，使HIF-1α不在羥基化，阻礙其降解。當HIF-1α在細胞質內到達一定量后，HIF-1α進入細胞核內與HIF-1β形成二聚體，并與p300/CBP蛋白相互作用，增強其活性。其后，HIF-1結合到VEGF、SDF-1等靶標基因啟動子或增強子區(qū)域的缺氧反應元件，促使相關基因轉錄，以此調控細胞產生應對低氧的反應，調控創(chuàng)面愈合。

2.3HIF-1在創(chuàng)面中的其他調控方式 除上述的早期創(chuàng)面以及慢性創(chuàng)面中的氧微環(huán)境對HIF-1活性的調控外，組蛋白脫乙酰基酶抑制劑也介導VHL依靠的HIF-1α蛋白的降解，并以此調控HIF-1活性。組蛋白脫乙酰基酶抑制劑促使HSP90超乙酰化，影響HSP90與HIF-1α的相互作用，形成不成熟的HIF-1α-HSP70復合體，以此影響HIF-1α的活性[19-20]。此外，被命名為CHIP(carboxy terminus of HSP70-interacting protein)的泛素連接酶也對HIF-1α的泛素化及長時間的低氧導致的蛋白的降解過程有著重要的調控作用，同時此過程也在分子伴侶的協(xié)助下增加乙二醛的含量[19]。乙二醛同時是糖酵解的側鏈產物，與α-酮戊二醛具有較高的親和性，在慢性創(chuàng)面中具有較高的活性且抑制PDHs的活性，阻礙HIF-1α的羥基化，對HIF-1活性起著重要的調控作用[16]。

盡管已有大量的研究證實HIF-1α的活性調控方式依靠PHD及VHL蛋白促使其降解，但也有證據表明HIF-1α亞基還受其他信號通路的調控，例如RACK1蛋白與HIF-1α蛋白及延伸因子C結合，與起到穩(wěn)定HIF-1α結構的熱激蛋白HSP90競爭性抑制，從而促進HIF-1α泛素化并降解[21]。磷酸化的信號轉導通路PI3K及MAPK也對HIF-1α亞基的調控及HIF-1活性對下游相關靶基因的轉錄及蛋白表達起著調控作用[22-23]。例如，上游正向調節(jié)蛋白如絡氨酸受體激酶RTKs及小G蛋白Ras的功能獲得型突變或者抑癌基因PTEN等腫瘤抑制基因的功能缺失型突變，均能通過PI3K信號通路增強HIF-1α基因的表達[24]。此外，MAPK介導的HIF-1α磷酸化并促使其與p300/CBP蛋白的結合，增強HIF-1的活性[25]。同時HIF-1α磷酸化還能使其不從核內向核外轉移，保護其活性。

3 小結與展望

低氧或缺氧是組織在創(chuàng)面尤其是慢性創(chuàng)面中常見的病理生理的反應。大量的研究已經證實，HIF-1α是低氧或缺氧條件下的關鍵轉錄調節(jié)因子，在促進創(chuàng)面細胞增殖、遷移及創(chuàng)面相關細胞因子的靶基因轉錄及表達起著重要的作用。HIF-1α活性的調節(jié)，也可能是創(chuàng)面尤其是難愈性創(chuàng)面治療新的切入點。雖然關于HIF-1α活性調節(jié)及下游信號對創(chuàng)面愈合的分子調節(jié)機制已有較多的認識，但將其準確地應用于臨床實踐還有很多的問題有待進一步解決。此外，相信隨著目前分子生物學研究技術的不斷進步，HIF-1α亞基的活性調節(jié)也很可能成為除創(chuàng)面外，很多低氧疾病新的靶標，也不斷為臨床治療提供新的參考。

[1]Schreml S,Szeimies RM,Prantl L,et al.Oxygen in acute and chronic wound healing[J].Brit J Dermatol,2010,163(2):257-268.

[2]Thangarajah H,Yao DC,Chang EI,et al.The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(32):13505-13510.

[3]Wang GL,Jiang BH,Rue EA,et al.Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2tension[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1995,92(12):5510-5514.

[4]Bento CF,Pereira P.Regulation of hypoxia-inducible factor 1 and the loss of the cellular response to hypoxia in diabetes[J].Diabetologia,2011,54(8):1946-1956.

[5]Dai Y,Xu MF,Wang YG,et al.HIF-1 alpha induced-VEGF overexpression in bone marrow stem cells protects cardiomyocytes against ischemia[J].J Mol Cell Cardiol,2007,42(6):1036-1044.

[6]Barliya T,Mandel M,Livnat T,et al.Degradation of HIF-1 alpha under hypoxia combined with induction of Hsp90 polyubiquitination in cancer cells by hypericin:a unique cancer therapy[J].PloS One,2011,6(9)：e22849.

[7]Li W,Li Y,Guan S,et al.Extracellular heat shock protein-90alpha:linking hypoxia to skin cell motility and wound healing[J].EMBO J,2007,26(5):1221-1233.

[8]金秀,王瀟飛,王紅紅,等.硫酸右旋糖苷抑制人胃癌細胞HIF-1α和整合素β1表達及其相關性[J].臨床與實驗病理學雜志,2016,32(01):53-57.

[9]Lee SH,Lee YJ,Han HJ.Role of hypoxia-induced fibronectin-integrin beta 1 expression in embryonic stem cell proliferation and migration:involvement of PI3K/Akt and FAK[J].J Cell Physiol,2011,226(2):484-493.

[10]Hon WC,Wilson MI,Harlos K,et al.Structural basis for the recognition of hydroxyproline in HIF-1 alpha by pVHL[J].Nature,2002,417(6892):975-978.

[11]Yuan Y,Hilliard G,Ferguson T,et al.Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha[J].J Biol Chem,2003,278(18):15911-15916.

[12]Hewitson KS,Lienard BMR,Mcdonough MA,et al.Structural and mechanistic studies on the inhibition of the hypoxia-inducible transcription factor hydroxylases by tricarboxylic acid cycle intermediates[J].J Biol Chem,2007,282(5):3293-3301.

[13]Cockman ME,Masson N,Mole DR,et al.Hypoxia inducible factor-alpha binding and ubiquitylation by the von Hippel-Lindau tumor suppressor protein[J].J Biol Chem,2000,275(33):25733-25741.

[14]Stebbins CE,Kaelin WG,Pavletich NP.Structure of the VHL-ElonginC-ElonginB complex:implications for VHL tumor suppressor function[J].Science,1999,284(5413):455-461.

[15]Lando D,Peet DJ,Gorman JJ,et al.FIH-1 is an asparaginyl hydroxylase enzyme that regulates the transcriptional activity of hypoxia-inducible factor[J].Genes Dev,2002,16(12):1466-1471.

[16]Weidemann A,Johnson RS.Biology of HIF-1 alpha[J].Cell Death Differ,2008,15(4):621-627.

[17]Sang N,Stiehl DP,Bohensky J,et al.MAPK signaling up-regulates the activity of hypoxia-inducible factors by its effects on p300[J].J Biol Chem,2003,278(16):14013-14019.

[18]Ceradini DJ,Kulkarni AR,Callaghan MJ,et al.Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1[J].Nat Med,2004,10(8):858-864.

[19]Bento CF,Fernandes R,Ramalho J,et al.The chaperone-dependent ubiquitin ligase CHIP targets HIF-1 alpha for degradation in the presence of methylglyoxal[J].PloS One,2010,5(11)：e15062.

[20]Luo W,Zhong J,Chang R,et al.Hsp70 and CHIP selectively mediate ubiquitination and degradation of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha but not HIF-2 alpha[J].J Biol Chem,2010,285(6):3651-3663.

[21]Liu YV,Baek JH,Zhang H,et al.RACK1 competes with HSP90 for binding to HIF-1 alpha and is required for O2-independent and HSP90 inhibitor-induced degradation of HIF-1 alpha[J].Mol Cell,2007,25(2):207-217.

[22]Guo C,Hao LJ,Yang ZH,et al.Deferoxamine-mediated up-regulation of HIF-1 alpha.prevents dopaminergic neuronal death via the activation of MAPK family proteins in MPTP-treated mice[J].Exp Neurol,2016,280(1):13-23.

[23]Yeh YH,Wang SW,Yeh YC,et al.Rhapontigenin inhibits TGF-beta-mediated epithelial-mesenchymal transition via the PI3K/AKT/mTOR pathway and is not associated with HIF-1 alpha degradation[J].Oncol Rep,2016,35(5):2887-2895.

[24]Maynard MA,Ohh M.The role of hypoxia-inducible factors in cancer[J].Cell Mol Life Sci,2007,64(16):2170-2180.

[25]Mylonis I,Chachami G,Samiotaki M,et al.Identification of MAPK phosphorylation sites and their role in the localization and activity of hypoxia-inducible factor-1 alpha[J].J Biol Chem,2006,281(44):33095-33106.

Q491.5

A

1671-8348(2017)31-4438-04

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.31.043

重慶市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研項目(20142071)。

陳興(1986-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事皮膚美容的臨床及科研。△

，E-mail：cqzyyzx@163.com。

2017-04-28

2017-07-17)