HMGB1與炎性因子在脊髓損傷患者血清中的表達(dá)及臨床意義*

王良勇，李建剛，張 春，張 俊，杜紅軍，崔 操，陳 森

(1.新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇市兵團(tuán)第一師醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，新疆阿克蘇 843000；2.湖北省十堰市太和醫(yī)院骨科 442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院骨科，湖北十堰 442000)

HMGB1與炎性因子在脊髓損傷患者血清中的表達(dá)及臨床意義*

王良勇1，李建剛1，張 春1，張 俊1，杜紅軍1，崔 操2，陳 森3

(1.新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇市兵團(tuán)第一師醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，新疆阿克蘇 843000；2.湖北省十堰市太和醫(yī)院骨科 442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院骨科，湖北十堰 442000)

HMGB1蛋白質(zhì)；白細(xì)胞介素6；腫瘤壞死因子α；脊髓；脊髓損傷

脊髓損傷在我國具有較高的發(fā)病率[1]，研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷的病理機(jī)制包括原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷，原發(fā)性脊髓損傷是外部暴力當(dāng)時(shí)造成的損傷，是不能通過醫(yī)學(xué)治療手段改變的；繼發(fā)性損傷是脊髓損傷后數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)發(fā)生的，目前研究的重點(diǎn)主要集中在這方面。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展使更多脊髓損傷患者從原發(fā)性損傷中存活下來，但是幸存患者的生活自理能力往往明顯下降，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量，并給家庭和社會帶來一定的負(fù)擔(dān)。因此，深入、全面地了解脊髓損傷發(fā)生的具體病理機(jī)制，開發(fā)出確切有效的藥物是脊髓治療中亟須解決的問題。高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一種強(qiáng)大的致炎因子，在脊髓損傷的繼發(fā)性損害中發(fā)揮重要的作用[2]，本文通過探討其在血清中的表達(dá)及意義，以期更深入地了解其在脊髓損傷中的作用，為脊髓損傷患者的診療帶來新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2007年1月至2014年1月在新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇市兵團(tuán)第一師醫(yī)院接受住院治療的脊髓損傷患者87例作為脊髓損傷組。其中男50例，女37例，年齡18～60歲，平均(42.3±13.5)歲；高處墜落傷40例，車禍41例，跌倒損傷6例；根據(jù)美國脊髓損傷協(xié)會(ASIA)殘損分級法，A級26例，B級20例，C級21例，D級20例；頸椎損傷患者27例，胸腰椎損傷患者60例；20例患者采用非手術(shù)治療，67例患者采用手術(shù)治療(主要根據(jù)患者的具體情況決定行前路減壓或者后路減壓手術(shù))；從創(chuàng)傷到入院時(shí)間為(12.8±4.1)h。入選標(biāo)準(zhǔn)：外傷致脊髓損傷，均經(jīng)過CT和磁共振成像(MRI)確診；排除標(biāo)準(zhǔn)：顱腦外傷并伴有認(rèn)知功能障礙的患者。另選同期在本院進(jìn)行健康體檢的健康者87例作為對照組，其中男54例，女33例，年齡18～62歲，平均(42.9±11.3)歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究均經(jīng)患者或其家屬知情和同意，并通過本院倫理委員會批準(zhǔn)。

表1 兩組血清中的HMGB1、IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平

a：P<0.05，與對照組比較

1.2方法

1.2.1血液標(biāo)本收集 分別于脊髓損傷后1、3、7 d空腹抽取肘靜脈血10 mL于肝素抗凝管中，對照組晨起空腹抽取靜脈血10 mL，3 000 r/min離心10 min，分離的血清于-80 ℃冰箱中保存待檢。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清中HMGB1、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)蛋白的表達(dá) 人HMGB1、IL-1β、IL-6和TNF-α的ELISA試劑盒購自聯(lián)科生物科技有限公司，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，測量前將試劑盒及標(biāo)本平衡至室溫，標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1∶1稀釋后加入50 μL于反應(yīng)孔內(nèi)，加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL于反應(yīng)孔，加入待測樣品50 μL于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50 μL的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育1 h。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加1次，每孔加入80 μL的親和鏈酶素，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育30 min。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。每孔加入底物A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃溫育10 min。避免光照。取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μL終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。在450 nm波長處測定各孔的光密度值(OD值)。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)血漿樣品的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對應(yīng)的濃度。

1.2.3脊髓損傷后神經(jīng)功能的評定 本研究對象脊髓損傷的嚴(yán)重程度按照ASIA分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估[3]。A ：完全性損傷，骶段S4～S5無任何運(yùn)動(dòng)及感覺功能保留；B：不完全性損傷神經(jīng)平面以下，包括骶段S4～S5存在感覺功能，但無任何運(yùn)動(dòng)功；C：損傷神經(jīng)平面以下有運(yùn)動(dòng)功能保留，一半以上的關(guān)鍵肌肌力小于3級；D：損傷神經(jīng)平面以下有運(yùn)動(dòng)功能保留，一半以上的關(guān)鍵肌肌力大于或等于3級；E：正常，感覺和運(yùn)動(dòng)功能正常。

2 結(jié) 果

2.1血清中的HMGB1、IL-6、IL-1β和TNF-α水平分析 與對照組相比，脊髓損傷組傷后1、3、7 d的HMGB1、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均較高(P<0.05)。脊髓損傷患者血清中HMGB1和IL-6水平在損傷后1 d明顯升高，在3 d后水平達(dá)峰值；IL-1β和TNF-α水平在傷后1 d最高，3、5 d后逐漸降低(表1)。相關(guān)性分析顯示傷后1、3 d中HMGB1水平與IL-6、IL-1β和TNF-α水平呈正相關(guān)(P<0.05)，見表2。

2.2不同程度脊髓損傷患者血清中的HMGB1水平 脊髓損傷后1、3 d，患者血清中HMGB1水平與脊髓損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)(P<0.05)，脊髓損傷的程度越重，患者血清中的HMGB1水平越高，見表2。

表2 不同程度脊髓損傷患者血清中HMGB1水平

3 討 論

繼發(fā)性脊髓損傷的機(jī)制包括免疫炎性反應(yīng)機(jī)制、氧化自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損傷、鈣離子內(nèi)流學(xué)說機(jī)制、興奮性氨基酸毒性作用和脊髓微循環(huán)障礙，其中，免疫炎性反應(yīng)在脊髓損傷中的作用逐漸受到重視[4]。脊髓損傷后，淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞通過破壞的血脊髓屏障浸潤到脊髓組織，釋放出大量的炎性細(xì)胞因子、彈性蛋白酶和活性氧加重脊髓損傷的程度；另一方面，脊髓組織固有的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓損傷后激活，也產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子。在炎性細(xì)胞因子中目前作用研究比較確切的主要是TNF-α、IL-1β和IL-6[5]，它們在脊髓損傷的血清和脊髓組織中水平均增加[6]，TNF-α可以通過損害內(nèi)皮細(xì)胞及活化中性粒細(xì)胞加重脊髓組織的損壞，此外還可以通過誘導(dǎo)IL-1β和IL-6的表達(dá)，抑制TNF-α的表達(dá)顯著改善脊髓損傷的預(yù)后；IL-1β同樣可以加重脊髓損傷的程度，抑制其表達(dá)可以減少脊髓神經(jīng)元的凋亡；IL-6具有致炎作用，它促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤損傷局部，同時(shí)抑制神經(jīng)功能的恢復(fù)，抑制其表達(dá)，可以顯著改善脊髓損傷的神經(jīng)功能評分[7]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-1β，IL-6和TNF-α在脊髓損傷患者的血清中水平明顯升高，這與以往研究結(jié)果具有一致性。

HMGB1是一組與染色質(zhì)相結(jié)合的組蛋白，一般情況下主要位于細(xì)胞核內(nèi)，起到穩(wěn)定染色質(zhì)的作用，在細(xì)胞受到外界信號刺激及壞死時(shí)可以從細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，進(jìn)而釋放到細(xì)胞外液中，一旦被釋放到細(xì)胞外液中，HMGB1能夠啟動(dòng)一系列炎癥相關(guān)的信號通路，加重炎性反應(yīng)[8]。 HMGB1在脊髓損傷傷灶周圍的組織中水平明顯升高，抑制其表達(dá)可以顯著改善脊髓損傷的預(yù)后，多中心的研究認(rèn)為HMGB1可以作為脊髓損傷治療的靶點(diǎn)[9]。以往研究發(fā)現(xiàn)血清中HMGB1水平在腦創(chuàng)傷、缺血性腦卒中和蛛網(wǎng)膜下腔出血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性損傷患者中明顯升高[10-12]，并且與患者的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGB1在脊髓損傷患者的血清中同樣存在高表達(dá)，并且與下游炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平密切相關(guān)，此外，HMGB1與脊髓損傷患者的病情嚴(yán)重程度同樣存在顯著相關(guān)性，脊髓損傷程度重的患者其血清中水平明顯高于損傷輕的患者，提示早期檢測患者血清中HMGB1對于判斷脊髓損傷病情的輕重具有重要意義。

綜上所述，HMGB1在脊髓損傷患者的血清中水平明顯升高，并與TNF-α、IL-1β及IL-6存在顯著相關(guān)性，此外研究發(fā)現(xiàn)HMGB1水平與脊髓損傷患者的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，提示早期檢測HMGB1可能有助于判斷脊髓損傷患者的預(yù)后。

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ExpressionandclinicalsignificanceofserumHMGB1andinflammatoryfactorsinpatientswithspinalcordinjury*

WangLiangyong1,LiJiangang1,ZhangChun1,ZhangJun1,DuHongjun1,CuiCao2,ChenSen3

(1.DepartmentofTraumaticOrthopedics,AksuCorpsFirstDivisionHospital,Aksu,Xinjiang843000,China; 2.DepartmentofOrthopedics,TaiheHospital,Shiyan,Hubei442000,China;3.DepartmentofOrthopedics,AffiliatedDongfengHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan,Hubei442000,China)

high-mobility group box 1；interleukin-6；tumor necrosis factor-alpha；spinal cord；spinal cord injury

目的探討高遷移率族蛋白1(HMGB1)在脊髓損傷患者血清中的表達(dá)及其臨床意義。方法收集2007年1月至2014年1月在新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇市兵團(tuán)第一師醫(yī)院就診的87例脊髓損傷患者作為脊髓損傷組，脊髓損傷的嚴(yán)重程度根據(jù)美國脊髓損傷協(xié)會(ASIA)殘損分級進(jìn)行評估，分別于脊髓損傷后1、3、7 d行靜脈采血，另外取87例健康成年人血清做對照組，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測患者血清中HMGB1、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，并分析HMGB1與IL-1β、IL-6、TNF-α的相關(guān)性及患者損傷程度的關(guān)系。結(jié)果脊髓損傷組傷后1、3、7 d的HMGB1、IL-6、IL-1β和TNF-α水平均較高。脊髓損傷患者血清中HMGB1和IL-6水平在損傷后1 d明顯升高，在3 d時(shí)水平達(dá)峰值；IL-1β和TNF-α在傷后1 d最高，3、5 d后逐漸降低。相關(guān)性分析表示傷后1、3 d中HMGB1水平與IL-6、IL-1β和TNF-α水平呈正相關(guān)(P<0.05)。髓損傷后1、3 d，患者血清中HMGB1水平與脊髓損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)(P<0.05)，脊髓損傷的程度越重，患者血清中的HMGB1水平越高。結(jié)論HMGB1在早期脊髓損傷患者血清中的水平顯著升高，并可作為早期脊髓損傷嚴(yán)重程度的評估指標(biāo)之一。

R651.2

A

1671-8348(2017)31-4339-03

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.31.006

湖北省教育廳課題(B20112106)。

王良勇(1980-)，副主任醫(yī)師，在讀碩士，主要從事骨科方面研究。

ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of serum high-mobility group box 1(HMGB1) in the patients with spinal cord injury (SCI).MethodsA total of 87 cases of acute SCI treated in the Aksu Corps First Division Hospital from January 2007 to January 2014 were collected as the SCI group.The SCI severity was evaluated according to the damage grade by the American Spinal Cord Injury Association(ASIA).Venous blood was collected on 1,3,7 d after SCI.Other 87 healthy adults served as the control group.The expression levels of serum HMGB1,interleukin-6 (IL-6),IL-1β and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) in the two groups were measured by ELISA.Then the correlation between the HMGB1 expression level with IL-1β,IL-6 and TNF-α and the relation between HMGB1 with SCI severity were analyzed.ResultsThe HMGB1,IL-6,IL-1 and TNF-α levels on 1,3,7 d after SCI in the SCI group were higher.The expression levels of serum HMGB1 and IL-6 on 1 d after SCI in the SCI patients were significantly increased,and reached the peak value on 3 d;the levels of IL-1β and TNF-α on 1 d after SCI were highest,and gradually decreased on 3,5 d.The correlation analysis showed that the expression levels of HMGB1 on 1,3 d after SCI were positively correlated with the IL-6,IL-1β and TNF-α expression levels(P<0.05).The serum HMGB1 expression level on 1,3 d after SCI was closely correlated with the SCI severity (P<0.05).The severe the SCI severity,the higher the serum HMGB1 expression level.ConclusionThe expression level of serum HMGB1 in the patients with early SCI is significantly increased,and can be used as one of indicators for assessing the severity of early SCI.

2017-03-26

2017-06-14)