姜黃素抑制多藥耐藥肝癌細(xì)胞HepG2/ADM的增殖及其機(jī)制研究*

耿燕娜,尹元元,武毅君，張文鑫

(1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院藥學(xué)部，河南開封 475000；2.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開封 475000; 3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000)

姜黃素抑制多藥耐藥肝癌細(xì)胞HepG2/ADM的增殖及其機(jī)制研究*

耿燕娜1,尹元元1,武毅君2，張文鑫3△

(1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院藥學(xué)部，河南開封 475000；2.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南開封 475000; 3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000)

姜黃素；多藥耐藥；P-糖蛋白；HepG2/ADM細(xì)胞

GengYanna1,YinYuanyuan1,WuYijun2,ZhangWenxin3△

多藥耐藥(MDR)是指對一種藥物具有耐藥性的同時，對其他結(jié)構(gòu)不同、作用靶點不同的藥物也具有耐藥性。MDR通常是導(dǎo)致抗感染藥物治療和抗腫瘤化療失敗的重要原因。通常來說，細(xì)菌的MDR主要與內(nèi)酰胺酶的變異有關(guān)，而腫瘤細(xì)胞的MDR通常與細(xì)胞膜上過度表達(dá)外排抗腫瘤藥物的蛋白有關(guān)，如：MDR基因mdr-1編碼的P-糖蛋白(P-gp)過度表達(dá)是其重要原因之一，P-gp能夠?qū)⒂H脂類化療藥物泵出細(xì)胞外，從而產(chǎn)生耐藥特性[1]。

肝癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，由于我國是乙型肝炎病毒(HBV)的高發(fā)區(qū)，因此，受肝癌威脅也最大，約占全球肝癌病死率的50%。盡管，治療肝癌的手段有了很大的提高，但由于MDR的存在，使得其化療的療效不盡如人意，因此尋找新的治療策略逆轉(zhuǎn)肝癌的MDR就顯得極其重要。

姜黃素(Curcumin)是從姜科植物姜黃中提取的一種酚類化合物，具有顯著的抗炎[2]、抗氧化[3]、抗缺血[4]、抗纖維化[5]、抗腫瘤[6]等生物活性。故本實驗用阿霉素(ADM)處理肝癌細(xì)胞株HepG2制備耐藥細(xì)胞株HepG2/ADM，用姜黃素處理該細(xì)胞，觀察其對該細(xì)胞的殺傷作用，并探討其抗耐藥的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑 HepG2肝癌細(xì)胞株購置中科院上海生科院細(xì)胞資源中心；姜黃素購自美國Sigma公司，純度大于96%，并用二甲基亞砜(DMSO)溶解，等量分裝，并-20 ℃保存?zhèn)溆茫籄DM購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司，用雙蒸水稀釋保存。RPMI-1640培養(yǎng)液、0.25%胰酶和胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購自大連寶生生物工程有限公司，mdr-1引物由美國Invitrogen公司設(shè)計并合成。P-gp單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，內(nèi)參抗體β-actin購自博鰲森生物有限公司。

表1 姜黃素對肝癌HepG2/ADM細(xì)胞增殖的抑制作用

*：P<0.01，與空白對照組或DMSO組比較；△：P<0.05,與同組內(nèi)24 h比較

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和HepG2/ADM的制備 HepG2肝癌細(xì)胞貼壁生長于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。耐藥細(xì)胞株的建立采用AMD大劑量沖擊和劑量遞增相結(jié)合的方法誘導(dǎo)產(chǎn)生，具體做法：測定AMD對HepG2細(xì)胞的最低耐受濃度，用終濃度為1 mg/L的AMD與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，存活細(xì)胞用含最低AMD耐受濃度的培養(yǎng)液共培養(yǎng)7～10 d，待細(xì)胞穩(wěn)定后傳代，再次用含1 mg/L的AMD的培養(yǎng)液共培養(yǎng)24 h，存活細(xì)胞接種于含較高濃度的AMD中，以此類推，直至HepG2細(xì)胞在含1 mg/L的AMD下穩(wěn)定生長和傳代，即建立耐藥菌株HepG2/ADM[7]。

1.2.2CCK-8試劑檢測姜黃素對HepG2/ADM細(xì)胞的殺傷作用 將處于對數(shù)生長期的HepG2/ADM細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁后，將不同濃度的姜黃素(5、10、20、40 mol/L)加入HepG2/ADM培養(yǎng)體系中，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。在培養(yǎng)相應(yīng)時間點后加入10 μL的CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，于酶標(biāo)儀上490 nm處比色。根據(jù)公式計算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力(%)=A490處理組/A490自然生長組×100%。

1.2.3R-123外排實驗 將處于對數(shù)生長期的處理的HepG/ADM細(xì)胞以2×104/L接種于24孔板內(nèi)，每孔終體積為1 mL。培養(yǎng)24 h后，棄上清液，加入R-123至終濃度為5 mg/ L，然后加入姜黃素(20 mol/L)，聯(lián)合繼續(xù)培養(yǎng)0、0.5、1、2 h后，收集上清用流式細(xì)胞儀上檢測(激發(fā)波長560 nm，發(fā)射波長 540～660 nm)R-123激發(fā)的熒光強度值表示細(xì)胞內(nèi)R-123濃度。

1.2.4RT-PCR 收集培養(yǎng)的各組HepG2/ADM細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌后，參照Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，用RT-PCR檢測各組細(xì)胞中mdr-1基因的表達(dá)量。mdr-1上游引物：5′-GTA CCC ATC ATT GCA ATA GC-3′；下游引物：5′-CAA ACT TCT GCT CCT GAG TC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為167 bp。內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT-3′；下游引物：5′-AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為228 bp。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸5 min,35個循環(huán);72 ℃ 延伸 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,凝膠成像掃描。用Quantity One灰度分析軟件進(jìn)行吸光度值計算。以目的基因mdr-1條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值作為mdr-1 mRNA的表達(dá)量，并重復(fù)3次。

1.2.5Western blot 收集各組細(xì)胞提取總蛋白，并測定蛋白的濃度為(2.12±0.24)mg/mL。取蛋白樣品20 μL，經(jīng)過SDS-PAGE電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，以5%脫脂奶粉TBST液封閉后，加入P-gp抗體4℃孵育過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h后，ECL底物化學(xué)發(fā)光顯色后曝光顯影。通過Chemi DocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，進(jìn)行曝光分析，然后計算其比值表示結(jié)果，即：相對吸光度=目的蛋白P-gp吸光度/ β-actin 蛋白吸光度。

2 結(jié) 果

2.1姜黃素抑制HepG2/ADM細(xì)胞的增殖 與空白對照組和DMSO組比較，當(dāng)姜黃素濃度為5、10 mol/L作用24 h時，對HepG2/ADM細(xì)胞的增殖活力無明顯影響(P>0.05)；而當(dāng)姜黃素濃度增加至20、40 mol/L時，其對肝癌細(xì)胞的增殖活力有明顯的抑制作用，呈劑量-依賴性(P<0.05)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，隨著作用時間的逐漸延長，不同濃度的姜黃素對HepG2/ADM細(xì)胞的增殖活力都有顯著的抑制作用，呈時間-依賴性(P<0.05)。見表1。

2.2姜黃素對肝癌HepG2/ADM內(nèi)R-123濃度的影響 流式細(xì)胞結(jié)果如圖1顯示：與空白對照組和DMSO組比較，當(dāng)姜黃素濃度為5、10 mol/L時，在每一個時間點，姜黃素對HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)的R-123的外排無明顯抑制作用，而當(dāng)濃度增加至20、40 mol/L時，在每一個時間點，姜黃素都能夠明顯地抑制細(xì)胞內(nèi)R-123的外排，即：增加了細(xì)胞內(nèi)ADM的藥物濃度。

*:P<0.05，與空白對照組或DMSO組比較

圖1姜黃素對肝癌HepG2/ADM內(nèi)R-123濃度的影響

2.3姜黃素抑制了耐藥肝癌HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)mdr-1 mRNA及其編碼的P-gp的表達(dá) PCR和Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組或DMSO組比較，當(dāng)姜黃素濃度為10 μmol/L時，HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)mdr-1 mRNA及其編碼的P-gp的表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)；當(dāng)姜黃素濃度增加至20 μmol/L時，mdr-1 mRNA和P-gp水平表達(dá)的相對OD值都有顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，具有濃度依賴性(圖2A和C)。進(jìn)一步結(jié)果還顯示，當(dāng)姜黃素濃度為20 μmol/L時，隨著藥物作用時間的延長，HepG2/ADM 胞內(nèi)mdr-1 mRNA和P-gp水平的相對OD值都逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，呈時間依賴性(見圖2B和D)。

A：不同濃度的姜黃素對耐藥肝癌HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)mdr-1 mRNA表達(dá)水平的影響；B：20 μmol/L 的姜黃素作用不同時間后對耐藥肝癌HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)mdr-1 mRNA表達(dá)水平的影響；C：不同濃度的姜黃素對耐藥肝癌HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)P-gp蛋白表達(dá)水平的影響；D：20 μmol/L 的姜黃素作用不同時間后對耐藥肝癌HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)P-gp蛋白表達(dá)水平的影響

圖2姜黃素對耐藥肝癌HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)mdr-1 mRNA和P-gp蛋白表達(dá)的影響和比較

3 討 論

MDR不僅是腫瘤治療過程中常見的問題之一，也是其面臨的巨大挑戰(zhàn)。耐藥的腫瘤細(xì)胞能夠有效地從細(xì)胞內(nèi)部防止抗瘤藥物的積聚，從而降低腫瘤細(xì)胞對抗瘤藥物的敏感度[8]。MDR形成的原因多樣，如P-gp的過度表達(dá)[1]，上游通路(NF-kappB和PI3K)活性的異常等[9]。其中，mdr-1基因及其編碼的P-gp在多種惡性腫瘤細(xì)胞中的過度表達(dá)是形成MDR的重要機(jī)制，也是腫瘤患者化療效果差、預(yù)后差、復(fù)發(fā)率高的重要原因。

肝癌是消化系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，因P-gp高表達(dá)引發(fā)MDR從而導(dǎo)致肝癌病死率居高不下，因此尋找有效的MDR逆轉(zhuǎn)劑一直是肝癌防治研究的熱點。 目前越來越多的研究表明，許多植物提取物，如：綠茶[10]、白藜蘆醇[11]等，因其廣泛的藥理特性和低毒性，在肝癌的治療和預(yù)防中有廣闊的應(yīng)用前景，但這些提取物對MDR的肝癌的治療作用及其機(jī)制卻鮮有研究。

姜黃素是一種多酚類植物提取物，因其良好的抗突變和抗癌作用，使其成為一種很有應(yīng)用前景的抗癌藥物。本研究利用姜黃素處理MDR的肝癌細(xì)胞株HepG2/ADM，觀察姜黃素對該細(xì)胞株的增殖作用的影響，并探討其機(jī)制。研究表明，姜黃素能夠明顯地抑制耐藥肝癌細(xì)胞的增殖，且這種抑制作用呈明顯的濃度-時間依賴性(P<0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測了姜黃素對R-123的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素也能夠明顯抑制細(xì)胞內(nèi)R-123的外排，也就是說姜黃素可以明顯增加細(xì)胞內(nèi)ADM的藥物濃度，使其增強抗肝癌的作用。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，姜黃素能夠明顯抑制與MDR密切相關(guān)的mdr-1 mRNA及其編碼的P-gp的表達(dá)水平，也呈濃度-時間依賴性。

總之，本研究顯示姜黃素能夠逆轉(zhuǎn)人肝癌耐藥細(xì)胞株HepG2/ADM的耐藥作用，其機(jī)制可能與抑制mdr-1及其編碼的P-gp的表達(dá)有關(guān)系，這或為治療耐藥肝癌指出了新的方向，也提供了一定理論依據(jù)，但其逆轉(zhuǎn)耐藥的確切機(jī)制仍有待深入研究。

[1]Liu Z,Duan ZJ,Chang JY,et al.Sinomenine sensitizes multidrug-resistant colon cancer cells (Caco-2) to doxorubicin by downregulation of MDR-1 expression[J].PLoS One,2014,9(6):98560.

[2]Machova Urdzikova L,Karova K,Ruzicka J,et al.The anti-inflammatory compound curcumin enhances locomotor and sensory recovery after spinal cord injury in rats by immunomodulation[J].Int J Mol Sci,2015,17(1):E49.

[3]Xiong ZE,Dong WG,Wang BY,et al.Curcumin attenuates chronic ethanol-induced liver injury by inhibition of oxidative stress via mitogen-activated protein kinase/nuclear factor E2-related factor 2 pathway in mice[J].Pharmacogn Mag,2015,11(44):707-715.

[4]Shah FA,Gim SA,Sung JH,et al.Identification of proteins regulated by curcumin in cerebral ischemia[J].J Surg Res,2016,201(1):141-148.

[5]Liu PY.Curcumin:another potential translational candidate for anti-fibrosis on heart failure?[J].Acta Cardiol Sin,2014,30(5):483-484.

[6]Pan Z,Chen C,Zhou Y,et al.Synthesis and cytotoxic evaluation of monocarbonyl analogs of curcumin as potential anti-tumor agents[J].Drug Dev Res,2016,77(1):43-49.

[7]Zhai BJ,Shao ZY,Zhao CL,et al.Development of characterization of multidrug resistant human hepatocarcinoma cell line in nude mice[J].World J Gastroenterol,2006,12(41):6614-6619.

[8]Fletcher JI,Haber M,Henderson MJ,et al.ABC transporter in cancer:more than just drug efflux pumps[J].Nat Rev Cancer,2010,10(2):147-156.

[9]Fey SJ,Wrzesinski K.Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line[J].Toxicol Sci,2012,127(2):403-411.

[10]Zhang Y,Duan W,Owusu L,et al.Epigallocatechin-3-gallate induces the apoptosis of hepatocellular carcinoma LM6 cells but not non-cancerous liver cells[J].Int J Mol Med,2015,35(1):117-124.

[11]Lombardi G,Vannini S,Blasi F,et al.In vitro safety/protection assessment of resveratrol and pterostilbene in a human hepatoma cell line (HepG2)[J].Nat Prod Commun,2015,10(8):1403-1408.

StudyoneffectofcurcuminininhibitingproliferationofmultidrugresistantlivercancerHepG2/ADMcellsanditsmechanism*

(1.DepartmentofPharmacy,HuaiheHospital,HenanUniversity,Kaifeng,Henan,475000;2.CollegeofPharmacy,HenanUniversity,Kaifeng,Henan,475000;3.FirstAffiliatedHospital,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou,Henan450000,China)

ObjectiveTo observe the inhibitory effect of curcumin on the proliferation of multidrug resistance liver cancer line HepG2/ADM cells and to explore its mechanisms.MethodsHepG2/ADM cells were prepared and cultured in vitro,and treated by different concentrations (5,10,20,40 μmol/L) of curcumin for 24,48,72 h respectively.The effect of curcumin on proliferation of HepG2/ADM cells was measured by CCK-8 reagent;the concentration of intracellular rhodamine-123(Rh-123) and adriamycin (ADM) were determined by flow cytometry;the level change of intracellular mdr-1 mRNA in each group was determined by RT-PCR,the P-gp protein level was detected by Western blot.ResultsCompared with the blank control and DMSO group,curucmin had more obvious inhibitory effect on HepG2/ADM cells proliferation (P<0.05),and could more remarkably inhibit the intracellular Rh-123 excretion(P<0.05).The RT-PCR and Western blot results showed that curcumin more significantly decrease the mdr-1 mRNA and P-gp protein levels in dose-time dependent manner (P<0.05).ConclusionCurcumin could significantly inhibit the proliferation of multidrug-resistant HepG2/ADM cells,and its mechanism may be related with inhibiting mdr-1 gene expression and its encoded P-gp protein level,which are closely related with MDR.

curcumin;multidrug-resistance;P-gp;HepG2/ADM cells

目的觀察姜黃素對多藥耐藥(MDR)的肝癌細(xì)胞株HepG2/ADM細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制。方法制備、培養(yǎng)HepG2/ADM細(xì)胞，然后用不同濃度的姜黃素(5、10、20、40 mol/L)處理該細(xì)胞24、48、72 h。采用CCK-8試劑檢測姜黃素對HepG2/ADM細(xì)胞的增殖活力的影響。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)羅丹明123(R-123)的濃度和阿霉素(ADM)的濃度；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測各組細(xì)胞內(nèi)mdr-1 mRNA的水平變化；用Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)P-糖蛋白(P-gp)水平的變化。結(jié)果與空白對照組和DMSO組相比，姜黃素對HepG2/ADM細(xì)胞增殖的抑制作用更加明顯(P<0.05)；更能夠明顯抑制細(xì)胞內(nèi)Rh123的外排(P<0.05)；RT-PCR和Western blot結(jié)果分別顯示，姜黃素對HepG2/ADM細(xì)胞內(nèi)的mdr-1 mRNA和P-gp水平更有明顯的降低(P<0.05)，且呈濃度-時間依賴性(P<0.05)。結(jié)論姜黃素可以顯著抑制多藥耐藥HepG2/ADM細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與抑制和MDR密切相關(guān)的mdr-1基因及其編碼的P-gp水平有關(guān)。

R962

A

1671-8348(2017)31-4329-03

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.31.003

河南省醫(yī)學(xué)科技公關(guān)計劃項目(201404035)。

耿燕娜(1983-)，副主任藥師，碩士，研究方向為中藥藥理與臨床藥學(xué)。△

，E-mail：zhangwenxin1983@163.com。

2017-03-20

2017-06-08)