傣藥雅盼對單側輸尿管梗阻大鼠TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導通路的影響*

王 堅，袁紅伶

(1.云南省第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，昆明 650032;2.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呈貢分院腎內(nèi)科，昆明 650500)

論著·基礎研究

傣藥雅盼對單側輸尿管梗阻大鼠TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導通路的影響*

王 堅1，袁紅伶2△

(1.云南省第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，昆明 650032;2.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呈貢分院腎內(nèi)科，昆明 650500)

傣藥雅盼；腎間質(zhì)纖維化；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；單側輸尿管梗阻；大鼠

腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟病進展的重要病理基礎，比腎小球硬化更能反映腎臟受損傷的程度[1]。如何抑制腎間質(zhì)纖維化一直是一個值得探討的話題。傣藥雅盼在民間長期運用于腎炎、風濕性關節(jié)炎等的治療。本研究將從分子生物學角度來證實傣藥雅盼在治療腎衰竭方面的作用，為民族醫(yī)藥的臨床應用提供科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物與試劑盒 雅盼由云南省中藥研究所提供；鹽酸苯那普利(洛丁新)購自北京諾華制藥有限公司；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1購自美國Santa Cruz公司；鼠抗β-actin單克隆抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司；Smad2、Smad7多克隆抗體購自美國Protech公司；MCP-1購自英國Abcam公司。

1.1.2實驗動物 清潔級雄性大鼠120只(6周齡，購自昆明醫(yī)科大學動物科)，體質(zhì)量(200±25)g，飼養(yǎng)條件：室溫18～25 ℃，相對濕度40%～60%，自由攝入標準飼料，飲用煮沸后冷卻的自來水，換墊料1次/天，光照，12 h光照/黑暗，照明時間8：00-20：00。

1.2方法

1.2.1動物造模與分組 120只大鼠分為假手術組(20只)及模型組。模型組又分為5組：生理鹽水對照組(對照組)，雅盼低劑量藥物組(低劑量組)，雅盼中等劑量藥物組(中劑量組)，雅盼高劑量藥物組(高劑量組)，苯那普利組，每組各20只。

單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型制作：大鼠右側臥位，備皮后常規(guī)消毒，3%戊巴比妥鈉局部麻醉，取左側背部肋下5 mm作切口，開腹，游離左腎及輸尿管，取中上段結扎，之后逐層縫合。假手術組開腹后游離輸尿管后即關腹。

1.2.2給藥方法 造模次日開始灌胃給藥。假手術組與對照組予生理鹽水5 mL灌胃；雅盼提液低、中、高劑量組分別為4.0、8.0、12.0 g/(kg·d)；苯那普利組予苯那普利混懸液5 mL/d灌胃，其有效劑量為0.467 mg/(kg·d)，共28 d。

1.2.3標本采集與處理 各組大鼠治療28 d后頸動脈取血，分離血清后送檢；脫頸處死大鼠，取左腎組織，10%甲醛固定，磷酸鹽緩沖液沖洗，二甲苯乙醇液脫水，石蠟包埋切片。

1.2.4檢測內(nèi)容及方法

1.2.4.1血清檢測 尿酶法檢測尿素氮(BUN)、苦味酸法檢測肌酐(Scr)。

1.2.4.2組織檢測 腎組織石蠟切片后進行HE染色及Masson染色。HE染色行常規(guī)顯微鏡檢查，同時計算腎小管損傷指數(shù)(TII)。Masson染色在400倍鏡下，觀察小管間質(zhì)病變。TII：即半定量分析腎小管間質(zhì)病變[2]。每張切片隨機選10個不含腎小球的視野，400倍光鏡下觀察，由3個參數(shù)進行判斷：蛋白管型和腎小管擴張、間質(zhì)炎性細胞浸潤、間質(zhì)纖維化程度。每個參數(shù)按0～3分評價：0分為正常；1分為輕度，視野內(nèi)損傷小于25%；2分為中度，視野內(nèi)損傷25%～50%；3分為重度，視野內(nèi)損傷大于50%。TII評分由腎臟所有視野的損傷等級評分加權平均計算而得。每個樣本腎小管間質(zhì)的評分為0～9分。

1.2.4.3免疫組織化學檢測 采用免疫組織化學法,磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照染色,檢測 TGF-β1、Smad2、Smad7的表達。每個觀察指標在同一標本中制作切片2張,采用不加一抗的方法作陰性對照,同樣也在每一組中作2張對照。出現(xiàn)黃褐色反應為陽性,相同部位不出現(xiàn)黃色反應為陰性。 陽性等級判斷指標：顯色強度、陽性細胞數(shù)。顯色強度有以下幾種表達:無色、黃色、淺黃色、黃褐色。免疫組織化學結果以Qwin550CW型圖像信號采集及分析系統(tǒng)進行灰度值測量。灰度值越高表明相應蛋白表達越低,反之則表明相應蛋白表達越高。

1.2.4.4反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測mRNA的表達 TGF-β1、Smad2、Smad7 mRNA水平檢測參照ABI試劑(SYBR Select Master Mix)RT-PCR操作說明進行，ABI7500熒光定量PCR儀器中進行，以β-actin為內(nèi)參，運用2-△△t法進行數(shù)據(jù)計算，△△CT=(CT目的基因-CT管家基因)實驗組-(CT目的基因-CT管家基因)。

1.2.4.5Western blot檢測蛋白表達 Western blot檢測Smad2和Smad7蛋白。取100 g腎組織勻漿，取上清液，以BCA蛋白試劑盒檢測勻漿液中蛋白濃度，將蛋白標本經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，TBST室溫封閉后與特異性的Smad2(1∶500)抗體和Smad7(1∶500)抗體共孵育，之后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體作用、洗滌，最后X線片記錄實驗結果，計算機成像分析儀，測定X線片上雜交條帶的吸光度值，代替蛋白表達量。全部試驗均用β-actin作內(nèi)參，以上每組操作重復3次。

2 結 果

2.1一般情況 各組大鼠傷口愈合良好，無感染。模型組進食量明顯少于假手術組，且鼠毛無光澤，同時聳毛、弓背、活動減少。雅盼各組及苯那普利組治療后，進食有所恢復，但仍不及假手術組，活動較前增加；但鼠毛無明顯變化。

實驗期間，假手術組及高劑量組無死亡，生理鹽水對照組死亡2只，中劑量組死亡2只，低劑量組及苯那普利組死亡1只。各組動物死亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2腎功能檢測 造模后28 d模型組BUN、Scr與假手術組比較，明顯增高(P<0.05)；但經(jīng)苯那普利及雅盼高、中、低劑量灌胃后BUN、Scr水平明顯低于對照組(P<0.05)；其中苯那普利組與高劑量組BUN、Scr低于中、低劑量組，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 治療后各組大鼠Scr、BUN水平

*:P<0.05,與假手術組比較；△:P<0.05,與對照組比較

2.3腎組織病理改變 光鏡下HE和Masson染色顯示，假手術組大鼠腎小球正常，腎小管-間質(zhì)輕微纖維化(面積小于5%)，未見炎性細胞浸潤。UUO各組大鼠腎小管上皮細胞空泡化，腎小管擴張明顯，部分腎小管萎縮，排列紊亂，腎間質(zhì)彌漫炎性細胞浸潤，Masson染色可見腎間質(zhì)局灶性纖維化。雅盼各治療組及苯那普利組，腎小管-間質(zhì)炎性細胞浸潤及腎間質(zhì)纖維化程度較對照組有所減輕，尤以高劑量組及苯那普利組減輕明顯(圖1～6)。TII評分顯示，UUO大鼠TII評分顯著高于假手術組(P<0．05)，但與對照組相比高、中劑量組及苯那普利組TII評分明顯改善(P>0．05)，低劑量組與對照組相比TII評分有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0．05)。見表2。

表2 各組大鼠TII評分、TGF-β1、Smad2、Smad7表達的比較

*:P<0.05，與假手術組比較；△：P<0.05，與對照組比較;○:單位為灰度值

圖1 各組HE染色情況

圖2 各組Masson染色情況

2.4各組大鼠腎臟組織的免疫組織化學結果

2.4.1TGF-β1及Smad2 mRNA表達 假手術組腎組織腎小球和腎小管上皮細胞中無或弱陽性表達。模型組表現(xiàn)為褐色顆粒狀沉積，著色較深，呈強陽性表達，主要集中在腎小管上皮細胞，腎小球也可見少量表達，假手術組與各模型組間的灰度值差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低劑量組、中劑量組、高劑量組及苯那普利組之間有不同程度的陽性表達，但均低于對照組。見圖3、4。

圖3 TGF-β1在各組中的表達情況

2.4.2Smad7 mRNA的表達 假手術組Smad7 mRNA在腎小球著色部位廣泛，呈棕黃色顆粒或塊狀，為強陽性表達，在腎小球的分布多于腎間質(zhì)，主要見于毛細血管壁、腎小球系膜細胞和腎小球囊上皮細胞。各模型組Smad7 mRNA的表達有不同程度抑制，與假手術組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。高劑量組、中劑量組與苯那普利組表達抑制情況有所改善，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低劑量組較對照組相比表達有所增強，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 Smad7在各組中的表達情況

2.4.3Smad2和Smad7 Western blot蛋白表達 見圖6。

M：Marker，D2000；1：假手術組；2：對照組；3：低濃度組；4：中濃度組；5：高濃度組；6：苯那普利組

圖6 Smad2、Smad7與β-actin電泳圖

3 討 論

腎間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的必經(jīng)通路。大量研究證明，TGF-β1是加速腎纖維化的最關鍵因素[3]。TGF-β1能加劇細胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生，對ECM基因表達、基質(zhì)降解、細胞增殖分化、細胞凋亡及免疫功能都具有一定影響[4]，是導致腎小球硬化，腎小管-間質(zhì)纖維化的重要因素[5]。Smads蛋白是TGF-β家族信號從受體到核的細胞內(nèi)傳導分子，調(diào)控細胞膜信號傳導，在慢性腎纖維化中，起重要作用[6-8]。Smad2與Smad3 同屬受體激活型Smad蛋白(R-Smad)，二者具有92%的同源性[9]。但有學者研究，大鼠敲除Smad3基因后，在TGF-β1刺激下，成纖維細胞依舊可以生成基質(zhì),顯示 Smad2 是許多基質(zhì)反應中的特異性調(diào)節(jié)因子[10-11]。Smad7屬于細胞內(nèi)Ⅰ型受體絲氨酸/蘇氨酸激酶的拮抗蛋白，它具有阻止R-Smads磷酸化及反饋調(diào)節(jié)TGF-β對靶基因轉(zhuǎn)錄的作用，是阻斷腎組織TGF-β1效應的關鍵[12-14]。已有不同學者對苯那普利延緩慢性腎衰竭病程進展方面的作用進行研究，結果均表明，該藥確實能調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導通路，抑制腎間質(zhì)纖維化[15-16]，故本研究中以此藥作為西藥對照。

UUO是研究腎小管間質(zhì)纖維化成熟的動物模型。本研究顯示，UUO大鼠腎間質(zhì)炎性細胞浸潤，腎小管擴張，壞死,空泡化，間質(zhì)纖維化，符合慢性腎小管間質(zhì)纖維化的特點。

傣藥雅盼系蕨類卷柏科卷柏屬植物。該藥已有長期且較為廣泛的運用，具有清熱利濕，止咳止血，抗炎作用[17]。而近年的研究提示該類藥含有大量雙黃酮類及阿魏酸棕櫚酸-16-醇酯等成分，具有抗病毒 、抗炎、 抗氧化、抗血栓及擴張血管作用[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)UUO模型組大鼠腎組織中TGF-β1、Smad2蛋白表達上調(diào)，而Smad7蛋白表達下調(diào)，TII評分明顯升高，腎功能明顯下降，而經(jīng)28 d干預后，雅盼低、中、高劑量組TGF-β1、Smad2蛋白表達較對照組均有不同程度的下調(diào)，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，中、高劑量組Smad7蛋白表達有不同程度上調(diào)(P<0.05)，而腎臟病理損傷程度較對照組有不同程度減輕：腎間質(zhì)炎性細胞浸潤、腎小管擴張，壞死及間質(zhì)纖維化程度也有不同程度減輕，腎功能有所恢復，TII評分明顯減低，其中、高劑量組及苯那普利組TII評分減低程度優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。

綜上所述，傣藥雅盼中、高劑量治療可以下調(diào)TGF-β1、Smad2蛋白表達，上調(diào) Smad7蛋白表達，通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導通路，減輕UUO大鼠術后腎臟病變，延緩腎小管損傷及腎纖維化進展。

[1]Li J，Zhang ZW，Wang DR,et al.TGF-beta 1/Smads signaling stimulates renal interstitial fibrosis in experimental AAN[J].J Recept Signal Transduct Res,2009,29(5):280-285.

[2]Goumenos DS,Tsamandas AC,Nahas AM，et al.Apoptosis and myofibroblast expression in human glomerular disease:a possible link with transforming growth-β1[J].Nephron,2002,92(2):287-296.

[3]Bottinger EP.TGF-β1 in renal injury and disease[J].Semin Nephrol,2007,27(3):309-320.

[4]李彧,陳朝青,李亞東,等.姜黃素對單側輸尿管梗阻大鼠腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化及TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導途徑的影響[J].中國中西醫(yī)結合雜志,2011,31(9):1224-1228.

[5]Kalman JM，Kumar S，Sander P．Markers of collagen synthesis，atrial fibrosis，and the mechanisms undedying atrial fibrillation[J].J Am Coll Cardiol，2012，60(18)：1807-1808．

[6]Leask A,Abraham DJ.TGF-β signaling ang the fibrotic response[J].Faseb J,2004,18(6):816-827.

[7]王偉銘,劉峰,陳楠.過氧化物酶體增殖物激活受體γ激動劑對大鼠腎成纖維細胞轉(zhuǎn)化生長因子β1/Smad信號途徑的作用研究[J].中華醫(yī)學雜志,2006,86(11):740-744.

[8]武貴群，高翔，梅長林．TGF-β/smads通路與腎臟纖維化研究進展[J].中國中西醫(yī)結合腎病雜志，2012，13(5)：459-461．

[9]趙俊芳,劉成,劉成海.轉(zhuǎn)化生長因子β胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導與Smads蛋白[J].中國病理生理雜志，2002,18(3):321-325.

[10]Ashcroft GS,Yang X,Glick AB,et al.Mice lacking Smad3 show accelerated wound healing and an impaired local inflammatory response[J].Nat Cell Biol,1999,1(5):260-266.

[11]Massage J,Wotton D.Transcriptional control by TGF-β/Smad signaling[J].Embo J,2000,19(2):1745-1754.

[12]武帥，郭兆安，于春江，等．芪蛭降糖膠囊對糖尿病腎病大鼠腎組織BMP-7及TGF-β/smads信號傳導通路的影響[J].中國中西醫(yī)結合腎病雜志，2014，15(4)：297-301．

[13]胡志娟，李英，何偉,等.苯那普利對糖尿病大鼠腎組織中TGF-β1和Smad7表達的影響[J].中國中西醫(yī)結合腎病雜志，2005，6(10)：569-572.

[14]姚鋼煉，寧寧，高登峰,等.苯那普利對單側輸尿管梗阻大鼠腎臟結締組織生長因子表達的影響[J].西安交通大學學報(醫(yī)學版),2006,27(4):362-364.

[15]卞保平，萬英，陳蓉,等.梗阻性腎病大鼠腎組織periostin的表達及意義[J].中華腎臟病雜志,2012,28(8):628-632.

[16]Niu HL,Nie L,Liu MD,et al.Benazepril affects integrin-linked kinase and smooth muscle ɑ-actin expression in diabetic rat glomerulus and cultured mesangial cells[J].BMC Nephrol，2014,15(2)：135-138.

[17] 張麗霞，管艷紅，馬潔，等.西雙版納民族民間習用藥用蕨類植物[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2004，11(6)：342-343.

[18] 張藝軒，石鐡.卷柏屬藥用植物生物活性研究進展[J].中成藥，2011,133(4):664-667.

[19]武帥，郭兆安，于春江，等．芪蛭降糖膠囊對糖尿病腎病大鼠腎組織BMP-7及TGF-β/smads信號傳導通路的影響[J].中國中西醫(yī)結合腎病雜志，2014，15(4)：297-301．

EffectofDaimedicineYapanonTGF-β1/Smadssignalingtransductionpathwayinunilateralureteralobstructionrats*

WangJian1,YuanHongling2△

(1.DepartmentofNephrology,YunnanProvincialFirstPeopleHospital,Kunming,Yunnan,650032,China； 2.TheFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversityChenggongSorting,Kunming,Yunnan650500,China)

Dai medician Yapan;renal interstitial fibrosis;transforming growth factor-β1;unilateral ureteral obstruction;rats

目的觀察傣藥雅盼對單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導通路的影響，從而探討該藥對腎間質(zhì)纖維化抑制作用的可能機制。方法120只雄性大鼠行單側輸尿管結扎建立UUO大鼠模型，生理鹽水灌胃或給藥28 d后收集血清檢測尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)，處死大鼠，取其腎組織行HE染色和Masson染色，免疫組織化學法檢測TGF-β1、Smad2、Smad7在腎組織的表達；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測mRNA的表達；Western blot檢測蛋白表達。結果傣藥雅盼各劑量組能降低大鼠BUN、Scr水平，并減輕腎小管-間質(zhì)炎性細胞及腎間質(zhì)纖維化程度，同時使TGF-β1、Smad2 mRNA和蛋白表達上調(diào)(P<0.05)，而Smad7 mRNA和蛋白表達下調(diào)(P<0.05)。結論傣藥雅盼各濃度組均可以在一定程度抑制Smad2 mRNA的表達，上調(diào)Smad7 mRNA的表達，通過干預TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導通路抑制了TGF-β1在腎組織的表達從而對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化。

R453.9

A

1671-8348(2017)31-4325-04

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.31.002

國家自然科學基金資助項目(81460649)。

王堅(1968-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事慢性腎衰竭及血液凈化研究。△

，E-mail：kmyuanhl@yeah.net。

ObjectiveTo observe the effect of Dai medicine Yapan on TGF-β1/Smads signaling transduction pathway in unilateral ureteral obstruction (UUO) rats,and to explore its possible mechanism in rat renal interstitial fibrosis inhibitory effect.MethodsThe UUO rat model was established by conducting the unilateral ureteral obstruction(UUO) in 120 male rats.Normal saline gavage or medication were performed for 28 d and serum was collected for detecting BUN and Scr.Then the rats were killed for taking the renal tissue and conducting HE and Masson staining.The expression of TGF-β1,Smad2 and Smad7 in kidney tissues were detected by using the immunohistochemical method.The mRNA expression was detected by RT-PCR;the protein expression was detected by Western blot.ResultsVarious Yapan doses groups could reduce the level of serum BUN and Scr in experimental rats,alleviated renal tubular interstitial inflammatory cells and renal interstitial fibrosis degree,meanwhile up-regulated the expression of TGF-β1,Smad2 mRNA and protein (P<0.05),while down-regulated the expression of Smad7 mRNA and protein (P<0.05).ConclusionDifferent concentrations groups of Dai medician Yapan may inhibit Smad2 mRNA expression in some extent,up-regulates Smad7 mRNA expression,inhibits the expression of TGF-β1 in kidney tissues through interfering TGF-β1/Smads signaling transduction pathway,thus obtains a therapeutic effect for inhibiting kidney interstitial fibrosis in UUO rat.

2017-03-24

2017-06-12)