紅樹林淡紫擬青霉胞外多糖對小鼠DCs吞噬功能的影響*

胡海巖,王華民,林英姿,楊 文,王永霞△

(海南醫學院：1.臨床學院；2.熱帶醫學與檢驗學院，海口 571109)

·論著·

紅樹林淡紫擬青霉胞外多糖對小鼠DCs吞噬功能的影響*

胡海巖1,王華民2,林英姿2,楊 文2,王永霞2△

(海南醫學院：1.臨床學院；2.熱帶醫學與檢驗學院，海口 571109)

胞外多糖；淡紫擬青霉；樹突細胞；成熟；免疫功能

樹突細胞(DCs)作為體內最重要的抗原提呈細胞，不僅是介導固有免疫和適應性免疫的橋梁，也是唯一能活化初始T細胞的抗原提呈細胞[1-3]。未成熟DCs由于高表達Toll樣受體(TLR)等[4]，獲取抗原的能力較強，但刺激T細胞活化的能力弱；病原體等抗原刺激可活化DCs，促使其分化成熟，成熟DCs識別抗原能力減弱，但由于高表達主要組合相容性復合體(MHC Ⅱ)類分子、CD86、CD80等分子，提呈抗原的能力及活化T細胞的能力增強[5-6]。因此，通過調控體內DCs的成熟狀態，可調節機體的免疫功能，達到預防或治療疾病的目的。

課題組前期從海南沿海紅樹林中分離獲得一株真菌，鑒定為淡紫擬青霉，體外試驗證實其產生的胞外多糖有較好的免疫調節作用，可促進小鼠吞噬細胞的吞噬功能并刺激T淋巴細胞分泌細胞因子[7]。本實驗將進一步探討該多糖對小鼠骨髓源性DCs成熟及功能的影響。

1 材料與方法

1.1動物 由本校實驗動物中心提供6～8周齡BALB/c小鼠，雄性。

1.2試劑及藥物 胞外多糖用ddH2O配成20 g/L母液，0.22 μm微孔濾膜過濾后分裝，-20 ℃凍存。APC標記的抗小鼠CD11c單克隆抗體、PE標記的抗小鼠MHC Ⅱ單克隆抗體、PE標記的抗小鼠CD80單克隆抗體、FITC標記的抗小鼠CD86單克隆抗體及FITC-dextran購自美國Ebioscience公司。Trizol試劑、反轉錄試劑盒、RPMI-1640培養基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。

1.3儀器 流式細胞儀(美國BD公司)，TC-512型PCR儀(英國Techne公司)，DYY-12C型穩壓穩流電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，凝膠圖像分析儀(英國Syngene公司)，生物安全柜(SG403A-HE，美國)，CO2培養箱(NU-4750E，美國)，倒置顯微鏡(深圳拓天儀器設備有限公司)，電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)，低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，細胞培養板(美國Corning公司)等。

1.4方法

1.4.1小鼠骨髓源性DCs誘導 取6～8周齡雄性BALB/c小鼠40只，SPF級，頸椎脫臼處死， 浸泡于75%乙醇中，10 min后無菌手術取股骨和脛骨，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復沖洗骨髓腔以獲取骨髓細胞，細胞懸液離心后重懸細胞，紅細胞裂解液裂解紅細胞，PBS洗3次，用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養液(含10 ng/mL rmGM-CSF和10 ng/mL rmIL-4)調整細胞濃度至2×106/mL，加入6孔板，每孔3 mL，置37 ℃、5% CO2培養箱吸附3 h后除掉未貼壁細胞，加入新的培養液，隔日半量換液，培養至第6天收集誘導的未成熟DCs進行后續實驗。

1.4.2多糖對DCs表面分子表達的影響 將獲得的小鼠骨髓細胞用RPMI-1640維持液稀釋成1×106/mL，接種于12孔板，每孔2 mL。用5個不同濃度梯度的多糖干預，即用終濃度分別為50、100、200、300、400 μg/mL的多糖處理細胞，每一濃度設8個復孔，陰性對照孔加等量的RPMI-1640維持液，隔天觀察細胞形態，48 h后收獲細胞，PBS洗滌3次，其中每一濃度中4復孔細胞用于TLR2 mRNA 和TLR4 mRNA表達的檢測，其余細胞調整濃度為1×106/mL，于細胞懸液中分別加入PE-CD80、FITC-CD86和 APC-CD11c、PE-MHC Ⅱ，4 ℃染色標記 30 min，洗滌3次，流式細胞術檢測細胞表型，實驗重復3次。

1.4.3多糖對未成熟DCs吞噬功能的影響 將小鼠骨髓細胞配制成1×106/mL，加入12孔板中，每孔2 mL，分別加入不同濃度多糖，使終濃度分別為50、100、200、300、400 μg/mL，每一濃度設4個復孔，37 ℃、5% CO2培養箱培養48 h，收集各孔細胞置37 ℃孵育30 min，加入終濃度為1 mg/mL的葡聚糖(FITC-dextran)，置37 ℃孵育4 h，再于4 ℃作用1 h后流式檢測結果，實驗重復3次。

1.4.4淡紫擬青霉胞外多糖對DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA表達的影響 總RNA抽提及cDNA制備：取1.2.2中收獲的細胞，按Trizol試劑說明書提取細胞總RNA。反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)獲得cDNA,-20 ℃保存備用。

常規PCR：按下表配制PCR反應體系并進行PCR擴增,TLR2、TLR4和β-action反應體系均為(引物序列見表1,由上海Sangon公司合成)：10×buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，2.5 U/μL TaqDNA聚合酶 0.3 μL，ddH2O 12.6 μL；反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環，最后72 ℃延伸8 min，PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統檢測各條帶光密度值，分析目的基因條帶與內參條帶光密度值的比值。

表1 TLR2、TLR4和β-action引物序列

2 結 果

2.1小鼠骨髓源性DCs誘導 小鼠貼壁的骨髓細胞經rmGM-CSF和rmIL-4誘導24 h 后，可見圓形、大小均勻的懸浮細胞。培養至第3天，可見疏松黏附與貼壁的細胞集落產生，細胞形態不規則。培養至第5天，部分細胞呈不規則狀，見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下不同時間DCs形態變化

2.2多糖對DCs表面分子表達的影響 未成熟DCs經不同濃度多糖干預48 h后，經流式細胞儀檢測發現所用濃度多糖均可刺激DCs 對CD11c、MHC-Ⅱ類分子、CD80和CD86的表達，且刺激效果呈劑量依賴性。經終濃度為50、100、200 μg/mL的多糖刺激后，CD11c、MHC Ⅱ雙陽性細胞百分率分別為(27.5±1.0)%、(29.7±1.1)%、(35.9±2.1)%，與空白對照組(25.5±0.9)%相比無明顯差異(P>0.05)，當多糖終濃度達300、400 μg/mL時CD11c、MHC Ⅱ雙陽性細胞百分率達(45.8±1.6)%和(54.4±1.3)%，明顯高于空白對照組(P<0.01)；該多糖亦可刺激DCs CD80和CD86的表達，糖終濃度為50、100、200、300、400 μg/mL時CD80、CD86雙陽性細胞百分率分別為(29.6±1.2)%、(33.1±1.7)%、(42.3±1.5)%、(53.6±1.4)%、(60.8±0.5)%，其中50、100 μg/mL終濃度多糖作用下CD80、CD86雙陽性細胞百分率與空白對照組[(25.9±1.2)%]差異無統計學意義(P>0.05)；200 μg/mL多糖作用下CD80、CD86雙陽性細胞百分率與空白對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，300、400 μg/mL多糖作用下CD80、CD86雙陽性細胞百分率與空白對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。說明終濃度為200、300、400 μg/mL多糖對DCs分化成熟的刺激作用較好，結果見圖2。

#：P>0.05,*:P<0.05,△：P<0.01,與空白對照組比較

圖2淡紫擬青霉胞外多糖對DCs表達CD11c、 MHC-Ⅱ、CD80和CD86分子的影響

圖3 淡紫擬青霉胞外多糖對DCs吞噬能力影響的部分流式圖

2.3多糖對未成熟DCs吞噬功能的影響 小鼠骨髓細胞經不同濃度多糖處理48 h后，吞噬FITC-dextran的能力逐漸下降， 50、100、200 μg/mL糖濃度時陽性吞噬細胞百分率分別為(31.5±1.3)%、(28.9±1.4)%和(26.0±1.4)%，與空白對照組[(34.6±1.1)%]相比差異無統計學意義(P>0.05)；當糖濃度達300、400 μg/mL時陽性吞噬細胞百分率明顯降低，分別為(20.6±1.0)%、(17.8±1.5)%，與空白對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，說明終濃度300 μg/mL和400 μg/mL的多糖對DCs成熟的刺激作用較強，結果見圖3。

*：P>0.05;#：P<0.05，與空白對照組比較

圖4淡紫擬青霉胞外多糖對DCs吞噬能力的影響

2.4淡紫擬青霉胞外多糖對DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA表達的影響 將不同濃度多糖作用于未成熟DCs 48 h后RT-PCR檢測TLR2和TLR4 mRNA表達情況，結果發現經終濃度為50～400 μg/mL多糖作用的DCs TLR2、TLR4 mRNA表達逐漸降低，50 μg/mL多糖作用下DCs TLR2、TLR4 mRNA相對表達量分別為0.818±0.112、0.644±0.083，與空白對照組相比(0.864±0.071、0.685±0.002)，差異無統計學意義(P>0.05)，100、200、300、400 μg/mL多糖作用下TLR2、TLR4 mRNA相對表達量分別為0.757±0.062、0.533±0.096，0.663±0.053、0.508±0.023，0.425±0.081、0.482±0.041、0.386±0.121、0.425±0.078，與空白對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5、6。

#：P>0.05;*：P<0.05，與空白對照組比較

圖5淡紫擬青霉胞外多糖對DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA表達的影響

泳道1：空白對照組，泳道2～6：50、100、200、300、400 μg/mL多糖處理組

圖6 DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA RT-PCR電泳圖

3 討 論

多糖類化合物含有豐富的生物信息，被認為是除肽鏈、核苷酸鏈之外具有重大意義的第3鏈，幾乎參與了細胞所有生命活動。作為紅樹林生態系統中的第二大微生物資源，紅樹林真菌長期生活在強酸、寡營養、高鹽的海洋環境中，必然有其獨特的分子適應機制，具備產生不同于陸生微生物的獨特新穎代謝產物的潛能，成為活性多糖的新來源[8-10]。本研究用紅樹林來源的淡紫擬青霉胞外多糖刺激小鼠骨髓源性DCs，觀察其對DCs成熟的誘導作用，發現多糖在所用濃度范圍內均可刺激DCs 分化成熟，具體表現為促進DCs 表面分子CD11c、MHC Ⅱ類分子及協同刺激分子CD80、CD86的表達，終濃度300 μg/mL和400 μg/mL的多糖刺激作用最強，CD11c、MHC Ⅱ雙陽性細胞和CD80、CD86雙陽性細胞百分率與空白對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，CD11c 為DCs特征性標志，MHC Ⅱ類分子參與抗原肽的提呈并誘導T細胞免疫應答的發生，CD80、CD86作為協同刺激分子，是T細胞活化的第二信號，DCs成熟時顯著上調MHC Ⅱ類分子、CD80、CD86等表面分子的表達，說明多糖對DCs的成熟具有刺激作用[11-12]。隨著DCs成熟其吞噬異物的能力大大降低，本研究發現經該多糖處理的DCs吞噬FITC-dextran的能力降低，尤其經300、400 μg/mL多糖作用的DCs陽性吞噬細胞百分率與空白對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，說明300、400 μg/mL的多糖可顯著促進DCs成熟。該多糖還可下調DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表達，尤其100～400 μg/mL多糖作用效果明顯，與空白對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，而TLR2和TLR4作為TLRs家族的成員，為重要的模式識別受體，部分多糖刺激的非特異性免疫反應可能通過TLR2和/或TLR4介導[13-14]。另外，課題組還發現該多糖可刺激IL-12分泌，IL-12可誘導Th0分化為Th1，參與Th1反應[15]，進一步說明該多糖能刺激DCs成熟。

總之，本研究初步發現紅樹林淡紫擬青霉胞外多糖具有刺激小鼠骨髓源性DCs分化成熟的作用，不僅可刺激DCs 表面分子CD11c 、MHC Ⅱ類分子的表達，還可刺激協同刺激分子CD80和CD86分子的表達，抑制其對異物的吞噬作用，下調TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表達，但作用機制不明，仍需進一步研究。

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EffectsofextracellularpolysaccharidesfromPaecilomycesLilacinusononphagocytosisfunctionofmousebonemarrow-deriveddendriticcells*

HuHaiyan1,WangHuamin2,LinYingzi2,YangWen2,WangYongxia2△

(1.ClinicalMedicalCollege;2.SchoolofTropicalMedicineandLaboratoryMedicine,HainanMedicalUniversity,Haikou,Hainan571109,China)

extracellular polysaccharides;Paecilomyces Lilacinuson;murine dendritic cells;maturation;immunologic function

目的探討紅樹林來源的淡紫擬青霉胞外多糖對小鼠骨髓源性樹突細胞(DCs)功能成熟的影響。方法從小鼠骨髓腔中分離獲得骨髓細胞，加入重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重組小鼠白細胞介素-4(rmIL-4)誘導分化為未成熟DCs，用不同濃度淡紫擬青霉胞外多糖干預，流式細胞術檢測DCs的表面標志CD11c、主要組合相容性復合體(MHCⅡ) 類分子、CD80、CD86的表達情況及吞噬葡聚糖(FITC-dextran)的能力，反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測該多糖對DCs Toll樣受體(TLR)2 mRNA和TLR4 mRNA表達的影響。結果經300、400 μg/mL多糖作用48 h后DCs 表面分子CD11c、MHC Ⅱ類分子、CD80、CD86的表達較空白對照組顯著上調(P<0.01)；經多糖作用的DCs吞噬FITC-dextran能力下降，尤其是300、400 μg/mL的多糖與空白對照組相比作用效果明顯(P<0.05)；另外，該多糖還可下調DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表達，尤其經100～400 μg/mL多糖處理的DCs下調作用顯著，與空白對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。結論淡紫擬青霉胞外多糖可上調小鼠骨髓源性未成熟DCs表面 CD11c、MHC Ⅱ類分子、CD80和CD86的表達，降低其吞噬能力，下調TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表達，初步表明該多糖可刺激DCs分化成熟。

R392.9

A

1671-8348(2017)31-4321-04

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.31.001

國家自然科學基金資助項目(31260225)；海南省自然科學基金資助項目(813248)；海南醫學院科研培育基金資助項目(HY2014-015)。

胡海巖(1979-)，講師，本科，主要從事感染免疫及免疫調節研究。△

,E-mai:492608405@qq.com。

ObjectiveTo investigate the effects of Paecilomyces Lilacinuson extracellular polysaccharides on the phenotypic and function maturity of mouse dendritic cells.MethodsMononuclear cells were isolated from the mouse bone marrow cavity and added with cytokines for obtaining the recombinant mouse granulocyte-macrophagocyte colony stimulating factor(rmGM-CSF),recombinant mouse interleukin 4(rmIL-4) was induced to differentiated to immature DCs.Then different concentrations of extracellular polysaccharides were used to conduct the intervention.The mature DCs surface marker CD11c,major histocompatibility complex Ⅱ(MHCⅡ),CD80,CD86 molecular expression and phagocytosing FITC-dextran ability was detected by the flow cytometry.The effect of the polysaccharides on DCs Toll-like receptor(TLR)2 mRNA and TLR4 mRNA expression was detected by RT-PCR.ResultsAfter 400 μg/mL polysaccharides action for 48 h, the expression of DCs surface molecules such as CD11c,MHCⅡ,CD80 and CD86 was significantly up-regulated compared with the blank control group (P<0.05);after the polysaccharides action,the ability of DCs phagocytosing FITC-dextran was decreased,especially the effects of 300,400 μg/mL of polysaccharides were more significant compared with the control group (P<0.05).In addition, the polysaccharides could down-regulate the expression of TLR2 mRNA and TLR4 mRNA in DCs, the DCs down-regulation effect after 100-400 μg/mL polysaccharides treatment, the difference compared with the blank control group was statistically significant(P<0.05).ConclusionThe extracellular polysaccharides can up-regulate the expression of DCs surface CD11c,MHCⅡ,CD80 and CD 86 molecules,decreases the phagocytosis ability and down-regulates the expression of TLR2 mRNA and TLR4 mRNA,which preliminarily indicates that the polysaccharides could stimulate the differentiation and maturation of murine DCs.

2017-03-18

2017-06-06)