熒光PCR技術在ICU抗菌藥物使用患者中檢測真菌感染的臨床意義

劉東育，趙洪偉，馬慶慶

（1.貴州航天醫(yī)院重癥醫(yī)學科；2.中心實驗室，貴州 遵義 563000）

熒光PCR技術在ICU抗菌藥物使用患者中檢測真菌感染的臨床意義

劉東育1，趙洪偉1，馬慶慶2

（1.貴州航天醫(yī)院重癥醫(yī)學科；2.中心實驗室，貴州 遵義 563000）

目的分析比較聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法在重癥加強護理病房（intensive care unit,ICU）抗菌藥物使用患者中檢測真菌感染的臨床意義。方法我院使用多種抗菌藥物的患者，取痰液60份，血液30份。將每例標本采集兩份，一份真菌培養(yǎng)，另一份凍箱保存，到一定數量后用PCR方法檢測真菌。結果在90份臨床標本中，二種方法均檢測出白色念珠菌、 熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌，以白色念珠菌為多。二種方法對念珠菌所檢出率無顯著性差異。結論PCR檢測疑似菌感染臨床標本具有快速簡便，穩(wěn)定性好、敏感性和特異性均較理想的特點，值得臨床實驗室推廣使用。

聚合酶鏈式反應；假絲酵母菌屬；真菌

真菌是醫(yī)院感染常見的病原菌，傳統(tǒng)的培養(yǎng)法時間長、靈敏度低，聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）法能快速、直接地檢測標本中感染的真菌，可以作為早期快速診斷的工具[1,2]。與一般細菌感染患者相比，假絲酵母菌屬感染患者的預后較差，因此有必要開發(fā)一種迅捷、準確的檢測方法[3]。本研究通過比較PCR檢測方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的診斷敏感性與準確性，旨在更早鑒定所感染的真菌，指導臨床合理用藥，提高抗真菌的治療效果。

1 材料與方法

1.1 臨床標本 收集2013年1月-2017年1月，我院在ICU中使用多種抗菌藥物，如：頭孢類藥物、喹諾酮類藥、亞胺培蘭-西司他丁鈉等或聯合用藥的90例患者，治療7天后仍持續(xù)發(fā)熱，臨床疑似真菌感染的病例標本：痰液60份，血液30份。90份標本中，男性52例，女性38例；平均年齡65歲；同一標本檢測出2種或≥3種菌株時，僅選用優(yōu)勢菌株。

1.2 傳統(tǒng)培養(yǎng)及科瑪嘉顯色鑒定 將臨床樣本接種于薩布羅培養(yǎng)基（天津市金章科技發(fā)展有限公司）中進行培養(yǎng)，涂片鏡檢為真菌后接種至科瑪嘉（鄭州博賽生物技術股份有限公司）假絲酵母菌顯色培養(yǎng)基（CHROMA-gar）中進行培養(yǎng)，假絲酵母菌屬類別根據菌落顏色的變化進行鑒定。白色假絲酵母菌為翠綠色，熱帶假絲酵母菌為藍灰色，克柔假絲酵母菌為粉紅色，光滑假絲酵母菌為紫色，其他假絲酵母菌為白色（如近平滑假絲酵母菌等）。

1.3 真菌基因提取及PCR擴增 待檢標本的真菌DNA用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取。根據假絲酵母菌IST1、ITS2及拓撲異構酶II的序列設計的不同種類的特異性引物，引物均由生工生物工程（上海）有限公司代為合成。以提取的基因組DNA為模板，采用以下試驗體系和程序進行PCR擴增，PCR反應體系（終濃度）：1×PCR緩沖液液（含MgCL2），上、下游引物各0.2 μmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，DNA模板，2.5 U TaqDNA聚合酶，滅菌ddH2O補至50 μL。擴增程序：94oC預變性3 min、94oC變性30 s、58oC退火1 min、72oC延伸1 min，30個循環(huán)、72oC延伸10 min。擴增完畢后，將PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5 μg/mL）中進行電泳，在Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)上進行分析、攝相，根據擴增片段大小來判斷假絲酵母菌的型別。每次PCR試驗整個過程需嚴格控制污染，均需設置空白對照（模板DNA用ddH2O代替）及陽性對照。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析所得數據，計數資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 假絲酵母菌屬的陽性率及標本來源分布 經傳統(tǒng)的薩布羅培養(yǎng)基培養(yǎng)并鏡檢后，90份疑似真菌感染的標本中真菌感染28份，陽性率為31.11%。見表1。

表1 PCR法與傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)法檢測標本結果

2.2 PCR方法對臨床標本的檢測 經PCR檢測發(fā)現，90份標本中陽性31份，陽性率為34.44%，其中白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌分別檢出21株、3株、1株。見圖1。

圖1 真菌基因提取及PCR擴增結果。M：Marker。內控：人固有基因組作為內控。5、6、7、8、10、11、12、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、32：白色念珠菌。1、4、31：熱帶假絲酵母菌。30：光滑假絲酵母菌。

2.3 PCR與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的比較 兩種方法對念珠菌所檢出率無顯著性差異，檢測一致性較好。

3 討論

本研究通過兩種不同的方法對90份疑似真菌感染標本進行檢測發(fā)現，PCR法與傳統(tǒng)薩布羅培養(yǎng)及科瑪嘉假絲酵母菌顯色法相比，對念珠菌的檢出率無統(tǒng)計學差異，說明檢測的一致性較好，但PCR法1個工作日即可出結果，提高了檢測效率，縮短檢測時間?？梢姡琍CR法具備方便、快速診斷等特點[3]。本研究所收集的疑似標本主要為痰液（其中痰液60份，血液30份），通過對這些感染標本進行PCR法及傳統(tǒng)假絲酵母菌數培養(yǎng)法的鑒定發(fā)現，最常見的真菌是白色假絲酵母菌，其次為熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌，與以往報道結果一致。

PCR是一種可快速診斷細菌或真菌感染的實驗室方法[4]。實驗的全過程要嚴格按照相關要求進行操作，并要求設計相關的空白和陽性對照，以便最大限度地保證試驗的準確性。隨著大劑量、長時間抗菌藥物的使用導致真菌感染的幾率加大，患者死亡率增加[5]。PCR檢測作為深部真菌感染的診斷方法更為快速、簡潔、敏感、準確。

綜上，PCR檢測疑似菌感染臨床標本具有快速簡便，穩(wěn)定性好、敏感性和特異性均較理想的特點，值得臨床實驗室推廣使用。

[1]Czurda S,Lion T.Broad-spectrum molecular detection of fungal nucleic acids by PCR-Based amplification techniques.Human Fungal Pathogen Identification: Methods and Protocols,2017: 257-266.

[2]Avni T,Leibovici L,Paul M.PCR diagnosis of invasive candidiasis: systematic review andmeta-analysis [J].J Clin Microbiol,2011,49(2): 665-670.

[3]Luo G,Mitchell TG.Rapid identification of pathogenic fungi directly from cultures by using multiplex PCR [J].J Clin Microbiol,2002,40(8): 2860-2865.

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[5]黃燕,陳玉坤,冀旭峰,等.ICU患者深部真菌感染的病原菌分布及耐藥性分析[J].吉林大學學報(醫(yī)學版),2017,43(1): 111-114.