標(biāo)本保存溫度和放置時(shí)間對(duì)D-二聚體檢測(cè)結(jié)果的影響

辜淑英，李芳＊

（1.九龍坡區(qū)中醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400080；2.重慶建設(shè)醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400050）

標(biāo)本保存溫度和放置時(shí)間對(duì)D-二聚體檢測(cè)結(jié)果的影響

辜淑英1，李芳2＊

（1.九龍坡區(qū)中醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400080；2.重慶建設(shè)醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400050）

目的探討標(biāo)本保存溫度和放置時(shí)間對(duì)D-二聚體（D-Dimer,D-D）檢測(cè)結(jié)果的影響。方法隨機(jī)選取2016年1月-2016年2月我院住院患者30例為研究對(duì)象，抽取所有患者空腹靜脈血，分離血漿后立即檢測(cè)D-D，檢測(cè)后血漿分成3份，分別保存在室溫、2oC-8oC、-20oC（僅凍融1次），室溫下保存2 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、10 h檢測(cè)D-D值；2oC-8oC保存1 d、3 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d檢測(cè)D-D值；-20oC下保存1周、2周、3周、4周、5周、6周檢測(cè)D-D值。分析D-D在不同保存溫度、不同保存時(shí)間下的穩(wěn)定性及變化趨勢(shì)。結(jié)果室溫下保存7 h、8 h、10 h的D-D測(cè)定值明顯高于即刻值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2oC-8oC下保存5 d、6 d、7 d、8 d、9 d的D-D測(cè)定值明顯高于即刻值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；-20oC下保存3周、4周、5周、6周的D-D測(cè)定值明顯高于即刻值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同溫度下，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，D-D測(cè)定值呈上升趨勢(shì)。結(jié)論臨床對(duì)于D-D的檢測(cè)應(yīng)及早進(jìn)行，在室溫下不宜超過(guò)6 h，2oC-8oC下不宜超過(guò)3 d，-20oC下不宜超過(guò)2周；隨著標(biāo)本放置時(shí)間的延長(zhǎng)，D-D測(cè)定值呈上升趨勢(shì)。

標(biāo)本保存溫度；放置時(shí)間；D-二聚體；檢測(cè)結(jié)果

D-二聚體（D-Dimer,D-D）是纖維蛋白單體經(jīng)活化因子X(jué)III交聯(lián)后，再經(jīng)纖溶酶水解所產(chǎn)生的一種特異性降解產(chǎn)物，是一個(gè)特異性的纖溶過(guò)程標(biāo)記物，主要來(lái)源于纖溶酶溶解的交聯(lián)纖維蛋白凝塊。正常人體內(nèi)并無(wú)D-D存在，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)凝血且繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)，導(dǎo)致血液中出現(xiàn)大量的D-D，而D-D在循環(huán)體內(nèi)半衰期為6 h左右[1,2]。相關(guān)研究表明[3,4]，D-D在惡性腫瘤、高血壓、先兆子癇、肝臟疾病、腎臟疾病、肺血栓栓塞、彌散性血管內(nèi)凝血等疾病的診斷、鑒別、病情評(píng)估、預(yù)后判斷中有重要作用。但在實(shí)際工作中，臨床D-D標(biāo)本由護(hù)士站采集后，送到檢驗(yàn)科進(jìn)行離心后檢測(cè)，從標(biāo)本采集到上機(jī)檢測(cè)完畢的時(shí)間長(zhǎng)短不一，且保存溫度也不一致，而在哪一段時(shí)間內(nèi)及溫度下檢測(cè)的結(jié)果是可靠的、可以接受的，目前國(guó)內(nèi)外沒(méi)有明確的標(biāo)準(zhǔn)[5]。因此，本研究采用免疫比濁法對(duì)30例住院患者的D-D進(jìn)行檢測(cè)，分析D-D在不同保存溫度、不同保存時(shí)間下的穩(wěn)定性及變化趨勢(shì)，探討可靠的標(biāo)本保存方式和檢測(cè)時(shí)間范圍，為臨床提供科學(xué)、準(zhǔn)確的診療依據(jù)。現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2016年1月-2016年2月我院住院患者30例，男性10例，女性20例；年齡20歲-93歲，平均年齡（52.36±2.55）歲；脾胃科11例，腦病科3例，外科6例，婦產(chǎn)科6例，腫瘤科3例，其他1例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料完整者；（2）年齡介于18歲-95歲之間者；（3）對(duì)本研究知情，并簽署同意書(shū)者；（4）依從性好，配合本次研究者；（5）膽紅素≤18 mg/dL，甘油三酯≤2,000 mg/dL，血紅蛋白≤500 mg/dL者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)者；（2）患有嚴(yán)重傳染性疾病者。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑 全自動(dòng)血凝儀CA1500由希森美康公司提供；離心機(jī)由湖南長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司提供；2oC-8oC冰箱由青島海爾股份有限公司提供；-20 oC冰箱由中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司提供；D-D測(cè)定試劑盒及配套校準(zhǔn)品、質(zhì)控品均由北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.2.2 樣本采集 抽取受檢者1.8 mL空腹靜脈血，加入裝有109 mmol/L枸櫞酸鈉（江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司，蘇食藥監(jiān)械生產(chǎn)許可20110062）0.2 mL的塑料真空采血管內(nèi)，輕輕顛倒混勻后，離心處理，轉(zhuǎn)速為3,000 r/min，離心10 min，分離血漿待測(cè)。若紅細(xì)胞比積（hematokrit,HCT）明顯異常，抗凝劑用量應(yīng)校正，校正公式如下：抗凝劑的體積=1.85×10-3×血量×（100-HCT）。

1.2.3 樣本檢測(cè) 標(biāo)本采集后立即經(jīng)免疫比濁法對(duì)D-D進(jìn)行檢測(cè)，此次測(cè)定值為即刻值。檢測(cè)原理：通過(guò)標(biāo)本中的D-D與鼠抗人D-D單克隆抗體膠乳顆粒產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，發(fā)生凝集導(dǎo)致濁度上升。測(cè)定濁度的變化量，計(jì)算出D-D的濃度。檢測(cè)后血漿分成3份，分別保存在室溫、2oC-8oC、-20oC（僅凍融1次），室溫下保存2 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、10 h檢測(cè)D-D值；2oC-8oC保存1 d、3 d、5 d、6 d、7 d、8 d、9 d檢測(cè)D-D值；-20oC下保存1周、2周、3周、4周、5周、6周檢測(cè)D-D值。每個(gè)標(biāo)本均重復(fù)測(cè)定3次，取3次平均值作為測(cè)定值。

1.2.4 儀器校正 在全自動(dòng)血凝儀上用D-D標(biāo)準(zhǔn)液和試劑作D-D定標(biāo)測(cè)定，應(yīng)用儀器自動(dòng)倍比稀釋的方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)標(biāo)本D-D濃度＞1.0 μg/mL時(shí)為陽(yáng)性，≤1.0 μg/mL為陰性，濃度＞30.0 μg/mL時(shí)需稀釋后作進(jìn)一步檢測(cè)，結(jié)果等于儀器測(cè)定值乘以稀釋倍數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo) 比較不同放置時(shí)間的D-D測(cè)定值與即刻值之間的差異，觀察其變化趨勢(shì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件校對(duì)全組數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用重復(fù)測(cè)量方差分析，結(jié)果Bonferroni校正；不同放置時(shí)間的D-D測(cè)定值與即刻值之間的比較，配對(duì)設(shè)計(jì)采用t檢驗(yàn)，以時(shí)間作x，測(cè)定結(jié)果為y，進(jìn)行一元一次線性回歸分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 室溫下D-D值 室溫下保存2 h、4 h、6 h的D-D測(cè)定值范圍為（2.95-3.70）μg/mL，與即刻值相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；室溫下保存7 h、8 h、10 h的D-D測(cè)定值明顯高于即刻值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。測(cè)定數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布（見(jiàn)圖1），將測(cè)定結(jié)果（y）與時(shí)間（x）進(jìn)行一元線性回歸分析，得出回歸方程為y=2.635+0.235x（R2=0.226），說(shuō)明在室溫下，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，D-D測(cè)定值呈上升趨勢(shì)。

2.2 2oC-8oC下D-D值 2oC-8oC下保存1 d、3 d的D-D測(cè)定值范圍為（3.00-3.70）ug/mL，與即刻值相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；2oC-8oC下保存5 d、6 d、7 d、8 d、9 d的D-D測(cè)定值明顯高于即刻值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。測(cè)定數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布（見(jiàn)圖2），將測(cè)定結(jié)果（y）與時(shí)間（x）進(jìn)行一元線性回歸分析，得出回歸方程為y=5.863-0.156x（R2=0.054），說(shuō)明在2oC-8oC下，D-D水平隨著保存時(shí)間呈上升趨勢(shì)。在2oC-8oC下，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，D-D測(cè)定值呈上升趨勢(shì)。見(jiàn)圖2。

2.3 -20oC下D-D值 -20oC下保存1周、2周的D-D測(cè)定值范圍為（3.20-3.70）μg/mL，與即刻值相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；-20oC下保存3周、4周、5周、6周的D-D測(cè)定值明顯高于即刻值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。測(cè)定數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布（見(jiàn)圖3），將測(cè)定結(jié)果（y）與時(shí)間（x）進(jìn)行一元線性回歸分析，得出回歸方程為y=5.417-0.040x（R2=0.011），說(shuō)明在-20oC下，隨著保存時(shí)間D-D測(cè)定值呈上升趨勢(shì)。

圖1 室溫下放置不同小時(shí)D-D測(cè)定值正態(tài)分布圖

表1 室溫下放置不同小時(shí)對(duì)D-D測(cè)定值的影響（Mean±SD,μg/mL）

3 討論

D-D是一種纖溶酶水解交聯(lián)纖維蛋白形成的降解產(chǎn)物，其含量的變化可作為機(jī)體內(nèi)原發(fā)性與繼發(fā)性纖溶鑒別及高凝狀態(tài)的重要指標(biāo)[6]。纖維蛋白溶解系統(tǒng)是人體最重要的抗凝系統(tǒng)，由纖溶酶抑制物、纖溶酶、纖溶酶原激活劑及纖溶酶原組成。當(dāng)纖維蛋白凝結(jié)塊形成時(shí)，在纖溶酶原激活劑的作用下，纖溶酶原被激活并轉(zhuǎn)化為纖溶酶，纖維蛋白開(kāi)始溶解，纖溶酶降解纖維蛋白凝結(jié)塊，并形成纖維蛋白產(chǎn)物，而纖維蛋白產(chǎn)物由D-D、片段E、中間片段及X-寡聚體[7]。人體纖溶系統(tǒng)可保持血管壁正常通透性、修復(fù)組織抗原及維持血液的流動(dòng)狀態(tài)，若人體D-D水平上升，則說(shuō)明存在繼發(fā)性纖溶過(guò)程[8]。溶栓治療是指用藥物來(lái)活化纖維蛋白溶解系統(tǒng)，投入組織型纖溶酶原活化物、尿液酶或鏈激酶等纖溶酶原活化物，生成大量的纖溶酶，從而溶解血栓，若D-D生成，則說(shuō)明溶栓效果已達(dá)到[9-11]。由此可見(jiàn)，D-D的檢測(cè)對(duì)于診斷與治療纖溶系統(tǒng)疾病、與纖溶系統(tǒng)有關(guān)疾病及溶栓治療監(jiān)測(cè)具有重要意義。

D-D的測(cè)定方法較多，包括乳膠顆粒凝集實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、膠體金免疫滲濾法、自身紅細(xì)胞凝集法及免疫比濁法，其中免疫比濁法、膠體金免疫滲濾法是使用最廣泛的兩種方法。乳膠顆粒凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)D-D優(yōu)點(diǎn)為快速，缺點(diǎn)為敏感性較低、結(jié)果重復(fù)性差，主要應(yīng)用于篩查中。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)D-D不受血紅蛋白、膽紅素、纖維蛋白產(chǎn)物及纖維蛋白原干擾，其優(yōu)點(diǎn)為敏感性、準(zhǔn)確性高，缺點(diǎn)為操作步驟復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、每次實(shí)驗(yàn)需帶標(biāo)準(zhǔn)曲線及抗原抗體反應(yīng)受溫度時(shí)間影響，因此不適用于臨床病人及時(shí)診斷及治療。膠體金免疫滲濾法檢測(cè)D-D優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便、可定量、靈敏度高及快速，缺點(diǎn)為特異性不強(qiáng)、受脂質(zhì)顆粒干擾[12]。自身紅細(xì)胞凝集法檢測(cè)D-D優(yōu)點(diǎn)是可用全血檢測(cè)，省去了離心制備血漿的麻煩。免疫比濁法檢測(cè)D-D具有重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、可定量、人為因素少等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)于儀器的要求較高。本研究采用了靈敏度高、能快速定量檢測(cè)的免疫比濁法對(duì)D-D進(jìn)行檢測(cè)。由于實(shí)際工作中，臨床D-D標(biāo)本從采集到上機(jī)檢測(cè)完畢的時(shí)間長(zhǎng)短不一，且保存溫度也不一致，有可能造成D-D水平出現(xiàn)變化。而本研究結(jié)果也表明，室溫下保存7 h、8 h、10 h和2oC-8oC下保存5 d、6 d、7 d、8 d、9 d及-20oC下保存3周、4周、5周、6周的D-D測(cè)定值高于即刻值，且隨著標(biāo)本放置時(shí)間的延長(zhǎng)，D-D測(cè)定值呈上升趨勢(shì)。提示臨床對(duì)于D-D的檢測(cè)應(yīng)及早進(jìn)行，在室溫下不宜超過(guò)6 h，2oC-8oC下宜超過(guò)3 d，-20oC-20oC下不宜超過(guò)2周。分析可能為隨著D-D標(biāo)本保存時(shí)間的延長(zhǎng)及溫度的上升，血漿中的凝血因子被活化，并對(duì)纖溶酶進(jìn)行激活，導(dǎo)致交聯(lián)纖維蛋白的形成并發(fā)生降解，從而造成D-D水平的上升。

本研究通過(guò)對(duì)不同保存溫度、不同保存時(shí)間下的D-D標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，分析其穩(wěn)定性及變化趨勢(shì)，為臨床更準(zhǔn)確的測(cè)定D-D值提供依據(jù)。但由于本研究收集樣本不多，結(jié)果可能存在偏倚，臨床需加大樣本數(shù)量進(jìn)一步探討。

綜上所述，臨床對(duì)于D-D的檢測(cè)應(yīng)及早進(jìn)行，在室溫下不宜超過(guò)6 h，2oC-8oC下宜超過(guò)3 d，-20oC-20oC下不宜超過(guò)2周；隨著標(biāo)本放置時(shí)間的延長(zhǎng)，D-D測(cè)定值呈上升趨勢(shì)。

圖2 室溫下放置不同天數(shù)D-D測(cè)定值正態(tài)分布圖

圖3 室溫下放置不同周D-D測(cè)定值正態(tài)分布圖

表2 2 oC-8 oC下放置不同天數(shù)對(duì)D-D測(cè)定值的影響（Mean±SD,μg/mL）

表3 -20 oC下放置不同周對(duì)D-D測(cè)定值的影響（Mean±SD,μg/mL）

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Influence of specimen storage temperature and storage time on test results of d-dimer

Shuying GU1,Fang LI2＊

1Traditional Chinese Medical Hospital of Jiulongpo District,Chongqing 400080,China;2Department of Clinical Laboratory,Chongqing Jianshe Hospital,Chongqing 400050,China

ObjectiveTo investigate the influence of specimen storage temperature and storage time on test results of D-dimer (D-D).Methods30 inpatients in our hospital from January 2016 to February 2016 were selected as research object,the fasting vein blood of all patients were taken,the D-D was instantly detected after plasma separation.After detection,the plasma was divided into 3 samples and stored at room temperature,in 2oC-8oC,-20oC (freezing and thawing only once).The samples were stored at room temperature 2 h,4 h,6 h,7 h,8 h,10 h and were detected D-D value; The samples were stored in 2oC-8oC 1 d,3 d,5 d,6 d,7 d,8 d,9 d and were detected D-D value; The samples were stored in -20oC 1 wk,2 wk,3 wk,4 wk,5 wk,6 wk and were detected D-D value.The stability and variation trend of D-D in different storage temperature and storage time were analyzed.ResultsThe D-D measured value which stored at room temperature 7 h,8 h,10 h were significantly higher than instant value (P＜0.05); The D-D measured value which stored in 2oC-8oC 5 d,6 d,7 d,8 d,9 d were significantly higher than instant value (P＜0.05); The D-D measured value which stored in -20oC 3 wk,4 wk,5 wk,6 wk were significantly higher than instant value (P＜0.05); Under different temperature,as storage time extended,the D-D detection value showed rising trend.ConclusionClinical D-D detection should be early took,and it should be at room temperature but no more than 6 h,in 2oC-8oC but no more than 3 d,in -20oC but no more than 2 wk; As specimen storage time extends,the D-D detection shows rising trend.

Specimen storage temperature; Storage time; D-dimer; Test results

重慶市衛(wèi)計(jì)委014年醫(yī)學(xué)科研指導(dǎo)項(xiàng)目（No.20143036）