MiR-152對轉化生長因子β1誘導的氣管上皮細胞向間質細胞轉化的影響

朱融和,孫媛媛,錢燕

(溫州醫科大學附屬第一醫院 兒科,浙江 溫州 325015)

MiR-152對轉化生長因子β1誘導的氣管上皮細胞向間質細胞轉化的影響

朱融和,孫媛媛,錢燕

(溫州醫科大學附屬第一醫院 兒科,浙江 溫州 325015)

目的:研究miR-152在轉化生長因子β1(TGF-β1)誘導的氣管上皮細胞向間質細胞轉化(EMT)中的表達情況,探討miR-152能否影響EMT的發生.方法:用10 ng/mL的TGF-β1誘導人氣管上皮16HBE細胞EMT發生,光鏡下觀察細胞形態變化,qRT-PCR和Western blot檢測細胞中EMT相關標志物α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、E-cadherin和Vimentin的改變;qRT-PCR檢測有或無TGF-β1處理的16HBE細胞中miR-152的表達情況;通過轉染miR-152 mimics和miR-NC至細胞后,再次檢測細胞中EMT標志物的表達情況.結果:與對照組比,TGF-β1處理72 h時能引起16HBE細胞發生EMT,細胞形態在72 h改變明顯,α-SMA和Vimentin表達增加,E-cadherin表達下降(P<0.01);轉染miR-152 mimics,細胞內miR-152的表達顯著增加(P<0.01);與miR-NC組比,轉染miR-152過表達后,氣管上皮細胞中α-SMA和Vimentin的表達降低(P<0.01),E-cadherin表達增加(P<0.01),EMT受到抑制.結論:TGF-β1能誘導離體培養的氣管上皮細胞發生EMT;miR-152可以抑制TGF-β1誘導的氣管上皮細胞EMT的發生.

哮喘;氣管上皮細胞;間質細胞;miR-152

哮喘是最常見的兒科疾病之一,其特征是嗜酸性粒細胞性氣道炎癥、可逆性氣道阻塞、氣道高反應性和氣道重塑[1].大多數國家的哮喘患病率逐年上升,哮喘的治療需要花費大量人力、物力和財力[2],但現有的控制哮喘的方式并不令人滿意.研究發現氣管上皮細胞向間質細胞轉化(epithelialmesenchymal transition,EMT)在氣道重塑中具有重要的作用[3].轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是公認的可以誘導EMT的因子,并且有報道稱哮喘患者肺組織內TGF-β表達上調[4].因此,本研究采用10 ng/mL的TGF-β1來誘導氣管EMT發生.MicroRNA(miRNA)是一種非編碼蛋白的小分子RNA,大量研究證實miRNA在兒童哮喘診斷和治療中的作用[5-7].MiR-152是miR-148/152家族的一員,可作為腫瘤抑制因子參與腫瘤進展.有研究發現miR-152的表達水平與哮喘的療效相關[8].

本研究通過qRT-PCR發現TGF-β1處理的氣管上皮細胞內miR-152的表達水平下降,提示miR-152可能參與TGF-β1誘導的EMT.隨后進一步通過轉染miR-152 mimics至人氣管上皮細胞,研究miR-152在TGF-β1誘導的氣管EMT中的作用,以期尋找早期干預哮喘氣道重塑的新途徑.

1 材料和方法

1.1 材料 人支氣管上皮細胞16HBE細胞株購自美國模式培養物集存庫(ATCC);TGF-β1抗體購自美國Sigma-Aldrich公司;MEM培養液、胰蛋白酶、1%青鏈霉素、胎牛血清購于美國Gibco公司;RNA提取試劑、轉染試劑脂質體Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司;miR-152 mimics及陰性對照miR-NC、PCR相關引物由上海生工公司設計合成;Takara反轉錄試劑盒、SYBR Green I熒光染料試劑盒購于大連寶生物公司;兔或鼠抗人E-cadherin、Vimentin、α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、GAPDH多克隆抗體購自英國Abcam公司;Western blot相關試劑、辣根過氧化酶標記的山羊抗兔或者抗鼠二抗購自江蘇碧云天生物技術研究所;倒置顯微鏡購自日本Olympus公司;ABI 7500 Fast PCR擴增儀購自美國Applied Bio-systems公司.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染:人支氣管上皮細胞16HBE在含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的MEM培養液中培養,常規置于37 ℃、5% CO2環境下生長.細胞融合至90%左右時常規傳代.配置10 ng/mL的TGF-β1的溶液并無菌處理,細胞在接受藥物處理前先用無血清培養液饑餓處理24 h.在倒置顯微鏡下(200倍)觀察不同時間TGF-β1處理后細胞的形態學變化.miR-152 mimics轉染按照Invitrogen公司提供的轉染說明書,應用Lipofectamine2000進行轉染.

1.2.2 實驗分組:細胞分為無TGF-β1處理組(對照組)、TGF-β1處理24 h組、48 h組和72 h組;在miR-152 mimics轉染支氣管上皮細胞后,將細胞分為TGF-β1處理48 h組、TGF-β1+miR-NC組和TGF-β1+miR-152 mimics組.

1.2.3 qRT-PCR檢測基因表達:用苯酚氯仿抽提法提取各組細胞中的總RNA,在NanoDrop2000紫外分光光度計測定A260 mm、A280 mm及RNA濃度.按照說明書將總RNA反轉錄成cDNA,反應體系為20 μL,反應條件為:16 ℃(30 min),45 ℃(30 min),80 ℃(5 min).隨后,以U6和GAPDH為內參基因,運用SYBR Green I法在ABI 7500 Fast PCR擴增儀上檢測目的基因的表達情況,反應條件為:預變性94 ℃(5 min),變性94 ℃(30 s),退火60 ℃(30 s),延伸72 ℃(60 s),擴增40個循環;最后72 ℃延伸8 min.每組樣品重復3次.目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法計算.各引物序列見表1.

表1 qRT-PCR相關引物序列

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達量:提取各組細胞總蛋白,用BCA法定量蛋白,SDS-PAGE每孔加入20 μL的樣品進行蛋白電泳,隨后用孔徑0.45 μm的PVDF膜行轉膜.常溫下TBST洗膜3次、封閉1 h,孵育α-SMA抗體(1:1 000)、E-cadherin(1:500)、Vimentin(1:2 000)和GAPDH(1:5 000),4 ℃過夜,常溫下TBST洗膜3次,再加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔(鼠)二抗孵育2 h,ECL化學發光法顯影;柯達膠片暗室顯影,Quantity One 4.0軟件計算蛋白條帶灰度值.蛋白表達強度以各條帶灰度值/GAPDH灰度值表示.

1.3 統計學處理方法 采用SPSS20.0和GraphPad Prism 5.5軟件進行統計分析.計量資料以表示,多組比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗.P<0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 TGF-β1刺激對氣管EMT的影響 對照組16HBE細胞分布呈鋪石路樣,形態成橢圓形或者是多邊,細胞間存在連接(見圖1A);TGF-β1 24 h組細胞形態改變不大(見圖1B),TGF-β1 72 h組細胞形態變為長梭形,并且細胞間隙較大(見圖1C).qRT-PCR檢測結果表明,與對照組比,TGF-β1 24 h組α-SMA和Vimentin mRNA開始增加,TGF-β1 72 h組α-SMA和Vimentin mRNA明顯升高,E-cadherin mRNA下降(P<0.01),見表2.Western blot發現16HBE細胞內α-SMA、Vimentin和E-cadherin蛋白的表達量在TGF-β1刺激后呈現出和相應的mRNA改變相同的趨勢(P<0.01),見圖2.

2.2 TGF-β1刺激氣管上皮細胞后miR-152的改變采用qRT-PCR發現10 ng/mL的TGF-β1處理16HBE細胞后,細胞內miR-152的表達量呈下降趨勢,在24 h開始下降(P<0.01),72 h和24 h比差異無統計學意義(P>0.05),見表2.

圖1 TGF-β1刺激對氣管上皮細胞形態學的影響(X200)

圖2 TGF-β1刺激對氣管EMT相關蛋白的改變

2.3 miR-152對氣管EMT的影響 轉染miR-152 mimics后,對照組、TGF-β1組、TGF-β1+miR-NC組和TGF-β1+miR-152 mimics組16HBE細胞內miR-152的2-△△CT值分別為1.03±0.13,0.62±0.06,0.67±0.10和31.70±1.31(P<0.01).qRT-PCR結果顯示,TGF-β1、TGF-β1+miR-NC和TGF-β1+miR-152 mimics組EMT標志蛋白存在明顯差異;與TGF-β1+miR-NC組比,TGF-β1+miR-152 mimics組α-SMA和Vimentin mRNA下降,而E-cadherin mRNA表達升高(均P<0.01),見表3.Western blot檢測發現,與TGF-β1組比,TGF-β1+miR-152 mimics組細胞中α-SMA和Vimentin蛋白表達減少,但E-cadherin蛋白表達增加(P<0.01),見圖3.

3 討論

目前治療哮喘的有關藥物,包括糖皮質激素、白三烯拮抗劑以及長效β2受體激動劑,對阻止或逆轉氣道重塑的作用非常有限[9].氣道重塑的始動因素為氣管內免疫細胞分泌炎癥介質,包括TGF-β、腫瘤壞死因子α和白介素等[10].有研究認為由于兒童時期肺組織生長迅速,氣道重塑很可能在兒童哮喘患者中已經發生[11].氣管EMT在哮喘相關的氣道重塑中具有重要作用,抑制EMT可以有效阻止氣道重塑的進展[12].氣管上皮細胞可以通過EMT向肌成纖維細胞轉變,引起細胞收縮能力增加和氣道的高反應性[3].EMT過程主要表現為氣管上皮細胞間連接缺失,變得松散;細胞極性消失;細胞形態由橢圓形向梭形轉變;上皮細胞標志物細胞角蛋白、緊密連接蛋白和E-cadherin下降,而間質細胞標志物Vimentin和N-cadherin表達升高;肌成纖維細胞相關蛋白α-SMA、成纖維細胞特異性蛋白Collagen等表達增加[13].TGF-β已被證實可以誘導內皮細胞EMT,是目前最常用的用來誘導EMT的藥物,因此本研究采用10 ng/mL的TGF-β1來誘導離體培養的氣管上皮16HBE發生EMT[14].

表2 TGF-β1刺激后α-SMA、Vimentin,E-cadherin mRNA和miR-152的改變(n=3,

表2 TGF-β1刺激后α-SMA、Vimentin,E-cadherin mRNA和miR-152的改變(n=3,

與對照組比:aP<0.01;與TGF-β1 24 h組比:bP<0.01

組別 α-SMA Vimentin E-cadherin miR-152對照組 0.99±0.09 0.96±0.04 0.98±0.14 1.09±0.11 TGF-β1 24 h組 1.35±0.13a 1.24±0.08a 0.81±0.09a 0.69±0.06a TGF-β1 72 h組 1.91±0.08b 1.55±0.14b 0.55±0.10b 0.52±0.09 F 36.78 87.96 36.40 24.61 P<0.001 <0.001 <0.001 0.0013

表3 MiR-152過表達對TGF-β1誘導的16HBE細胞EMT相關基因的影響(n=3,

表3 MiR-152過表達對TGF-β1誘導的16HBE細胞EMT相關基因的影響(n=3,

與TGF-β1+miR-NC組比:aP<0.01

組別 α-SMA Vimentin E-cadherin TGF-β1組 1.79±0.12 1.48±0.17 0.62±0.06 TGF-β1+miR-NC組 1.75±0.16 1.39±0.14 0.65±0.11 TGF-β1+miR-152 mimics組 0.96±0.08a 1.01±0.05a 0.95±0.06a F 39.32 137.43 26.44 P<0.001 <0.001 0.0019

圖3 MiR-152過表達對TGF-β1誘導的16HBE細胞EMT相關蛋白的影響

TGF-β1處理16HBE細胞24 h和48 h,通過細胞大體形態、EMT標志物mRNA和蛋白的改變等綜合表現,驗證了10 ng/mL TGF-β1誘導實驗細胞EMT的有效性.哮喘患者氣管上皮細胞內miRNAs表達存在異常,提示其可能參與上皮細胞異常介導的哮喘病理生理機制[15].因此,我們檢測TGF-β1處理的細胞內miR-152的表達情況,意外發現其表達下降,在設置時間梯度后發現miR-152在TGF-β1處理24 h后下降明顯,而72 h表達量與前者差異無統計學意義.鑒于大量研究發現miRNA在內皮細胞EMT中的作用[16-17],我們猜測miR-152也參與了TGF-β1誘導的氣管EMT.

研究表明miR-152作為一個抑癌因子參與腫瘤的發生發展[18],但是對于其在哮喘中的作用的研究卻寥寥無幾.2015年,NAIDOO等[8]在他汀類藥物改善哮喘的機制研究中,使用辛伐他汀處理B淋巴母細胞永生細胞株,檢測miR-152家族(包括miR-148a、miR-148b和miR-152)的表達變化,發現miR-152表達明顯升高,并且上調的miR-152能靶向結合HLA-G的3'-UTR,引起其降解,從而改善肺功能.為了探討miR-152是否參與哮喘的氣道重塑,我們通過miRNA模擬物轉染提高細胞內miR-152的表達量,結果發現miR-152過表達可以抑制TGF-β1誘導的16HBE細胞的EMT.并且miR-152過表達不僅逆轉EMT相關蛋白,同時對EMT相關標志物轉錄層面產生影響,這提示miR-152很可能通過作用于某個靶基因從而調節這些相關基因的轉錄.因此,在后續實驗中我們將進一步尋找miR-152作用的可能潛在靶點,深入探討miR-152在TGF-β1誘導氣管上皮細胞EMT中的作用,并通過動物實驗進一步證實miR-152參與哮喘的氣道重塑.

綜上所述,本研究通過細胞實驗發現miR-152介導TGF-β1誘導的氣管EMT,為抑制EMT相關的哮喘氣道重塑治療提供新的思路.

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(本文編輯:趙翠翠)

The effects of miR-152 on transforming growth factor-beta1-mediated epithelial-mesenchymal transition in human bronchial epithelial cells

ZHU Ronghe, SUN Yuanyuan, QIAN Yan.
Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To verify whether transforming growth factor-beta1 (TGF-β1) could induce epithelial-mesenchymal transition (EMT) in vitro and to determine the role of miR-152 in TGF-β1-mediated EMT in bronchial epithelial cells.Methods:10 ng/mL of TGF-β1 was used to induce the EMT of human bronchial epithelial cells 16HBE. Morphological changes were observed and qRT-PCR and Western blot were employed to test the alteration of αSMA, E-cadherin and Vimentin, thus to verify the occurrence of EMT. qRT-PCR was then used to test the expression profile of miR-152 in TGF-β1 treated 16HBE cells. After miR-152 was successfully transfected into 16HBE cells, EMT related markers were then detected using qRT-PCR and Western blot.Results:Compared with control group, TGF-β1-treated cells presented a myofibroblast-like morphology,especially at 72 h, characteristic by the loss of cell-to-cell junction, denovo expression of α-SMA and Vimentin,and loss of epithelial marker E-cadherin (P<0.01). The expression levels of miR-152 in TGF-β1 treated 16HBE cells were dramatically increased after transfected with miR-152 mimics (P<0.01). Compared with the control group, α-SMA and Vimentin were decreased, whereas E-cadherin was increased in the miR-152 group (P<0.01),suggesting overexpression of miR-152 could reverse the EMT induced by TGF-β1 in 16HBE cells.Conclusion:TGF-β1 induces EMT of human bronchial epithelial cells in vitro; miR-152 inhibits TGF-β1-mediated EMT in 16HBE cells.

asthma; bronchial epithelial cells; mesenchymal cells; miR-152

R725.6

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.10.008

2017-04-13

溫州市科技計劃項目(2014Y0143).

朱融和(1985-),女,浙江溫州人,住院醫師,碩士.

錢燕,主任醫師,碩士生導師,Email:qianyan_paw@163.com.