丙泊酚對(duì)大鼠初級(jí)軀體感覺(jué)皮層神經(jīng)元電壓門控鉀通道的影響

何炯策,張宇,劉興奎,喻田,黃千瑜

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科,浙江 溫州 325027;2.遵義醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)系,貴州 遵義 563003)

丙泊酚對(duì)大鼠初級(jí)軀體感覺(jué)皮層神經(jīng)元電壓門控鉀通道的影響

何炯策1,張宇2,劉興奎2,喻田2,黃千瑜1

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科,浙江 溫州 325027;2.遵義醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)系,貴州 遵義 563003)

目的:探討丙泊酚對(duì)大鼠S1區(qū)神經(jīng)元電壓門控鉀通道的影響.方法:使用全細(xì)胞記錄腦片膜片鉗技術(shù)測(cè)定神經(jīng)元細(xì)胞外向鉀電流.人工腦脊液中灌流不同濃度(10、30、100、300 μmol/L)丙泊酚,記錄各組瞬間外向鉀電流(IA)和延遲整流鉀電流(IK),繪制外向鉀通道電流電壓(IV)曲線、穩(wěn)態(tài)激活曲線并計(jì)算相關(guān)參數(shù).結(jié)果:丙泊酚呈濃度依賴性抑制大鼠S1區(qū)神經(jīng)元電壓門控性IA,延緩瞬間外向鉀通道的激活,使穩(wěn)態(tài)激活曲線向去極化方向移動(dòng).同時(shí)丙泊酚呈濃度依賴性抑制大鼠S1區(qū)神經(jīng)元電壓門控性IK,但不影響延遲整流鉀通道的激活.結(jié)論:丙泊酚對(duì)大鼠丘腦皮層環(huán)路中的S1區(qū)神經(jīng)元電壓門控鉀通道的抑制作用可能是其誘導(dǎo)的全麻作用的機(jī)制之一.

丙泊酚;大鼠;膜片鉗;鉀通道

丙泊酚(propofol)目前被廣泛應(yīng)用于各年齡段患者手術(shù)的麻醉,以及包括人流、宮腔鏡、無(wú)痛取卵、胃腸鏡等在內(nèi)的門診短小手術(shù)及檢查,其作用特點(diǎn)是快速、強(qiáng)效,維持時(shí)間短,可用于靶控輸注,蘇醒迅速、平穩(wěn)、舒適[1].丙泊酚藥物效應(yīng)的確切機(jī)制尚不明確,主流的觀點(diǎn)認(rèn)為丙泊酚與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GABA能神經(jīng)傳遞的增強(qiáng)相關(guān),表現(xiàn)為興奮性傳導(dǎo)的減弱及突觸抑制的上調(diào)[2],同時(shí)與神經(jīng)元細(xì)胞膜上的電壓門控離子通道關(guān)系密切.前期研究證實(shí)丙泊酚呈劑量相關(guān)性影響大鼠初級(jí)軀體感覺(jué)皮層(S1)區(qū)神經(jīng)元電壓門控鈉通道及動(dòng)作電位(action potential,AP)的閾值、超射值[3],而丙泊酚是否會(huì)影響神經(jīng)元鉀電流的外流,該作用是否協(xié)同其對(duì)鈉通道的抑制從而影響AP的產(chǎn)生和傳播仍不明確.本研究使用全細(xì)胞記錄腦片膜片鉗技術(shù),進(jìn)一步評(píng)估丙泊酚與S1區(qū)神經(jīng)元電壓門控鉀通道之間的藥物效應(yīng).

1 材料和方法

1.1 材料 SPF級(jí)SD大鼠36只,雌雄不限,7~14日齡,購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(渝)2007-0005.丙泊酚(1%,意大利阿斯利康公司),人工腦脊液(artificial cerebro-spinal fluid,ACSF):NaCl 126 mmol/L,CaCl22 mmol/L,KCl 2.5 mmol/L, MgSO4.7H2O 2 mmol/L, NaHCO325 mmol/L,NaH2PO4.2H2O 1.5 mmol/L,Glucose.H2O 10 mmol/L;電極內(nèi)液:KCl 120 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,CaCl21 mmol/L,MgCl2.6H2O 2 mmol/L,EGTA 10 mmol/L,Na2-ATP 3 mmol/L;細(xì)胞外液:NaCl 126 mmol/L,CaCl22 mmol/L,KCl l2.5 mmol/L,MgSO4.7H2O 2 mmol/L,NaHCO325 mmol/L,NaH2PO4.2H2O 1.5 mmol/L, Glucose.H2O 10 mmol/L, TTX 0.001 mmol/L,pH值7.35~7.45. BX51W1-IR7顯微鏡, HM 650V全自動(dòng)切片機(jī),P-97微電極拉制儀,EPC10膜片鉗放大器等.

1.2 方法

1.2.1 分組:分為對(duì)照組(Control組)及實(shí)驗(yàn)組,Control組灌流普通ACSF,實(shí)驗(yàn)組分為:Pro10組(ACSF中灌流丙泊酚10 μmol/L),Pro30組(30 μmol/L),Pro100組(100 μmol/L)及Pro300組(300 μmol/L),每組8例.

1.2.2 腦片的制備:參照課題組相關(guān)文獻(xiàn)[5].

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用PatchMaster、Fit-Master、SPSS、Origin進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄、提取、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖表繪制,數(shù)據(jù)均用±s表示.2組間比較用LSD檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析.鉀通道穩(wěn)態(tài)激活曲線繪制,半數(shù)激活電壓(V1/2)及曲線斜率因子(κ)的具體計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[4].P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 S1區(qū)神經(jīng)元外向鉀電流 鉗制膜電位為-80 mV時(shí),神經(jīng)細(xì)胞去極化時(shí)主要激活瞬時(shí)外向鉀電流(transient outward potassium currents,IA)及延遲整流鉀電流(delayed rectifier potassium current,IK)2種鉀電流成分,見(jiàn)圖1A.鉗制膜電位設(shè)定為-40 mV,細(xì)胞外向電流僅包含IK,見(jiàn)圖1B.IA迅速激活并失活,IK緩慢激活并不失活,根據(jù)2類不同電流成分的電活性特征,記錄圖1A紅箭頭所示電流峰值為IA,記錄圖1B紅箭頭所示的電流值為IK(155 ms).

圖1 S1區(qū)神經(jīng)元鉗制膜電位為-80 mV及-40 mV時(shí)的外向鉀電流圖

2.2 丙泊酚與IA、IV曲線 待細(xì)胞破膜穩(wěn)定后施加脈沖刺激方波,記錄各組電流曲線,見(jiàn)圖2.分別以不同膜電位及所對(duì)應(yīng)的IA值為坐標(biāo)軸,繪制瞬間外向鉀通道電流電壓(current-voltage,IV)曲線.與Control組比,其他各組IA的激活閾電位未發(fā)生明顯改變(-50 mV),IV曲線隨著丙泊酚濃度的上升呈顯著性下移,見(jiàn)圖3.4組實(shí)驗(yàn)組以膜電位為+90 mV時(shí)的IA值為峰值,并以Control組為基準(zhǔn)計(jì)算抑制率[抑制率=(Control組IA峰值-不同實(shí)驗(yàn)組IA峰值)/Control組IA峰值],IA峰值抑制率呈濃度依賴性上升,見(jiàn)圖4.

2.3 丙泊酚對(duì)IA激活的影響 脈沖刺激方波待細(xì)胞穩(wěn)定后施加刺激,記錄各組電流曲線,見(jiàn)圖5.所得IA值使用公式G=I/(V-Vrev)進(jìn)行電導(dǎo)值計(jì)算,并以最大值為基準(zhǔn)進(jìn)行比值轉(zhuǎn)換.根據(jù)伯爾茲曼方程分別擬合出Control組和Pro100組IA的穩(wěn)態(tài)激活曲線,見(jiàn)圖6,同時(shí)計(jì)算V1/2及κ.與Control組比,Pro100組曲線向右下方移位,V1/2顯著增大(P<0.01),但2組κ值未發(fā)生明顯變化(P>0.05),見(jiàn)表1.

2.4 丙泊酚與IK、IV曲線 脈沖刺激方波待細(xì)胞穩(wěn)定后施加刺激,記錄Control組和4組實(shí)驗(yàn)組電流曲線,繪制延遲整流鉀通道IV曲線,見(jiàn)圖7.與Control組比,4組實(shí)驗(yàn)組IK的激活閾電位未發(fā)生明顯變化(-30 mV),IV曲線隨著丙泊酚濃度的上升呈顯著性下移,見(jiàn)圖8.4組實(shí)驗(yàn)組以膜電位為+90 mV時(shí)的IK值為峰值,并以對(duì)照組為基準(zhǔn)計(jì)算抑制率,結(jié)果顯示IK值抑制率呈濃度依賴性上升,見(jiàn)圖9.

圖2 IA的刺激方波和電流曲線圖

圖3 Control組及各實(shí)驗(yàn)組IA電壓曲線圖

圖4 4組實(shí)驗(yàn)組IA峰值抑制率圖

圖5 IA激活的刺激方波和電流曲線圖

圖6 Control組與Pro100組IA穩(wěn)態(tài)激活曲線圖

2.5 丙泊酚對(duì)IK激活的影響 脈沖刺激方波待細(xì)胞穩(wěn)定后施加刺激,記錄各組電流曲線,見(jiàn)圖10.所得IK值使用公式G=I/(V-Vrev)及伯爾茲曼方程分別擬合出Control組和Pro100組IK的穩(wěn)態(tài)激活曲線,見(jiàn)圖11.同時(shí)計(jì)算V1/2及κ.丙泊酚并不顯著影響IK激活過(guò)程,與Control組比較,Pro100組曲線未發(fā)生明顯移位,2組V1/2及κ差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表2.

表1 IA的V1/2和κ值(n=8,

表1 IA的V1/2和κ值(n=8,

與Control組比:aP<0.01

組別 激活V1/2 κ Control組 -26.70±3.51 27.23±2.52 Pro100組 -17.03±2.03a 24.99±1.42

3 討論

意識(shí)的產(chǎn)生和維持依賴于皮層、丘腦、中腦等多腦區(qū)的共同參與.全身麻醉效應(yīng)引起的意識(shí)消失是由于藥物作用使得大腦中各腦區(qū)的聯(lián)系中斷,而這種中斷可能是信息內(nèi)容的改變,包括電活動(dòng)的頻率、時(shí)程的改變,或者部分缺失導(dǎo)致信息的碎片化.它可以發(fā)生在腦區(qū)信息傳導(dǎo)的單個(gè)環(huán)節(jié)或者信息轉(zhuǎn)導(dǎo)的整合過(guò)程.

圖8 Control組及各實(shí)驗(yàn)組IK電壓曲線圖

圖9 4組實(shí)驗(yàn)組IK值抑制率圖

圖10 IK激活的刺激方波和電流曲線圖

圖11 Control組與Pro100組IK穩(wěn)態(tài)激活曲線圖

表2 IK的V1/2和κ值(n=8

表2 IK的V1/2和κ值(n=8

組別 激活V1/2 κ Control 5.89±0.84 14.97±1.12 Pro100 4.45±1.41 14.81±1.17

神經(jīng)元的電活動(dòng)是生物對(duì)外界信息處理、加工和傳遞的基本形式,離子通道則是電活動(dòng)產(chǎn)生的基礎(chǔ).研究證實(shí)丙泊酚呈濃度相關(guān)性抑制S1區(qū)神經(jīng)元電壓門控鈉通道并影響AP的相關(guān)參數(shù).該抑制效應(yīng)是通過(guò)改變通道電導(dǎo)及通道動(dòng)力學(xué)特性實(shí)現(xiàn)的[3].鉀通道在AP的產(chǎn)生中同樣扮演著重要的角色,其活性決定AP產(chǎn)生的頻率和形態(tài),并與神經(jīng)元突觸連接的強(qiáng)度和信號(hào)整合密切相關(guān)[5].IA參與調(diào)節(jié)AP早期復(fù)極化,任何影響該通道電導(dǎo)和開(kāi)放的因素都可以使細(xì)胞去極化的速度變慢,最終影響AP的發(fā)放.IK是AP復(fù)極化時(shí)中后期的主要成分[6],其幅度直接影響AP時(shí)程、幅度和頻率,是細(xì)胞興奮性和傳導(dǎo)性的關(guān)鍵影響因素.本研究結(jié)果顯示,丙泊酚對(duì)鉀通道存在直接的抑制作用,該效應(yīng)是通過(guò)IA及IK所共同介導(dǎo)的.一方面丙泊酚呈濃度相關(guān)性抑制IA的外流,減緩IA的激活過(guò)程,使曲線往去極化方向移位,但該過(guò)程中反映曲線變化速率的κ沒(méi)有發(fā)生明顯變化,因此瞬時(shí)外向鉀通道是丙泊酚作用的可能位點(diǎn)之一.丙泊酚通過(guò)改變通道電導(dǎo)及激活過(guò)程,引發(fā)AP早期電壓依賴性鉀通道的開(kāi)放延遲,從而減慢AP的生成,降低發(fā)放頻率.另一方面大鼠S1區(qū)神經(jīng)元IK的外流由于丙泊酚存在而受到抑制,該效應(yīng)和丙泊酚存在濃度相關(guān)性.對(duì)IK通道動(dòng)力學(xué)上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,丙泊酚不改變IK的激活過(guò)程,V1/2及κ的改變不明顯.丙泊酚延長(zhǎng)AP時(shí)程及有效不應(yīng)期同時(shí)降低神經(jīng)沖動(dòng)發(fā)放頻率是通過(guò)影響AP產(chǎn)生的電壓門控鈉、鉀離子通道來(lái)實(shí)現(xiàn),并可能進(jìn)一步影響神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)傳入信號(hào)的整合作用.丙泊酚對(duì)其他腦區(qū)也存在類似效應(yīng),JONES等[7]報(bào)道丙泊酚能抑制SD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元由電流激發(fā)的動(dòng)作電位和自發(fā)性動(dòng)作電位.

生物體內(nèi)的信息傳遞依靠神經(jīng)細(xì)胞之間的電信號(hào)傳導(dǎo),意識(shí)的產(chǎn)生依賴于以神經(jīng)細(xì)胞為基礎(chǔ)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的整體運(yùn)作.ANDRADA等[8]的研究顯示,丙泊酚對(duì)皮層、丘腦、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)具有類似的藥物效應(yīng),它能減少神經(jīng)元自發(fā)AP的發(fā)放,引起腦電圖的改變,可能導(dǎo)致了最終的意識(shí)消失,但3者之間如何共同作用仍不清楚.離子通道及AP的改變可能以神經(jīng)元電活動(dòng)的形式通過(guò)各級(jí)的傳入、傳出神經(jīng)纖維被無(wú)限放大,進(jìn)一步影響相關(guān)腦區(qū)的聯(lián)系,發(fā)揮廣泛的中樞抑制作用,最終抑制或阻斷中樞系統(tǒng)的信息整合導(dǎo)致意識(shí)的消失.丙泊酚對(duì)大鼠丘腦皮層環(huán)路中的S1區(qū)神經(jīng)元電壓門控鉀通道的抑制作用是其誘導(dǎo)的全麻作用的可能機(jī)制之一.

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(本文編輯:吳彬)

Effects of propofol on potassium channels of S1 neurons in rats

HE Jiongce1, ZHANG Yu2, LIU Xingkui2,YU Tian2, HUANG Qianyu1.
1.Department of Anesthesia and Perioperative Medicine, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Anaesthesiology, Zunyi Medical College, Zunyi, 563003

Objective:To explore the effects of propofol on voltage-gated potassium channels of primary S1 neurons in rats.Methods:Whole-cell patch clamp technique was used to record potassium currents of neurons.After application with propofol at different concentrations (10-300 μmol/L) in ACSF, the currents of outward potassium currents (IA) and delayed rectifier potassium currents (IK) were recorded to make current-voltage curve,steady-state activation curve and account characteristic parameters.Results:Propofol inhibited IA of S1 neurons in rats in a dose-dependent manner. It also inhibited the activation of IA, shifted the activation curve towards the deperpolarzating potential. Propofol inhibited IK of S1 neurons of rats in a dose-dependent manner. But it did not affect activation of IK.Conclusion:The results of this study provide new vidence that propofol shows an inhibitory effect on voltage-gated potassium channels in the thalamocortical circuit, which may play a role in the mechanisms of propofol-induced general anesthesia.

propofol; rats; patch clamp; potassium channel

R614.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.10.003

2017-02-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81060266).

何炯策(1986-),男,浙江溫州人,住院醫(yī)生,碩士.