piRNA在胃癌與正常胃黏膜組織中表達的比較

蔣佩佩,蔡一奇,王鵬飛,陳孝冬,金勁激,胡暢遠,陳文靜,薛向陽,張麗芳,朱冠保

(1.溫州醫科大學附屬第一醫院 胃腸外科,浙江 溫州 325015;2.溫州醫科大學 分子病毒與免疫研究所 微生物學與免疫學教研室,浙江 溫州 325035)

piRNA在胃癌與正常胃黏膜組織中表達的比較

蔣佩佩1,蔡一奇1,王鵬飛1,陳孝冬1,金勁激1,胡暢遠1,陳文靜1,薛向陽2,張麗芳2,朱冠保1

(1.溫州醫科大學附屬第一醫院 胃腸外科,浙江 溫州 325015;2.溫州醫科大學 分子病毒與免疫研究所 微生物學與免疫學教研室,浙江 溫州 325035)

目的:分析piRNA在胃癌組織與正常胃黏膜組織中表達的差異性.方法:通過新一代高通量測序技術Solexa對胃癌組織和正常胃黏膜組織進行小分子RNA(sRNA)深度測序,并通過生物信息學分析胃癌組織與正常胃黏膜組織中piRNA的表達差異.根據分析結果選取4種piRNA(登錄號分別為DQ570956、DQ575659、DQ594126和DQ597128),通過莖環反轉錄實時定量PCR(簡稱莖環RT-qPCR)技術驗證其存在及其在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達差異.結果:Solexa深度測序結果顯示,正常胃黏膜與胃癌組織中測得的piRNA種類在各標本所測得所有sRNA種類中所占的比例差異無統計學意義(Z=0.835,P=0.678);正常胃黏膜組織中測得的piRNA數量在各標本所測得sRNA總量中所占的比例高于胃癌組織,差異有統計學意義(Z= 2.167,P=0.042);根據分析結果選取4種piRNA,經莖環RT-qPCR法檢測顯示,這4種piRNA在胃癌組織中的表達量顯著低于正常胃黏膜組織,差異有統計學意義(P<0.05).結論:胃癌組織存在多種差異表達的piRNA,且在表達量上與正常胃黏膜組織存在顯著性差異,本研究選取的4種piRNA可能參與胃癌的發生發展進程.

胃腫瘤;piRNA;小分子RNA;聚合酶鏈反應

胃癌是全球發病率最高的五大惡性腫瘤之一[1].目前,我國胃癌每年的發病率持續上升,且呈現顯著的年輕化趨勢,發病率和病死率均居我國惡性腫瘤第三位[2-3].尋求新的胃癌標記物及有效的生物治療靶點是進一步改善胃癌預后的關鍵.Piwiinteracting RNA(piRNA)是近年來在動物生殖細胞中發現的一類新小分子非編碼RNA,長度為26~32個核苷酸,主要集中在29~30 nt,能特異性地同Argonuat(AGO)蛋白家族中的Piwi亞家族蛋白相互結合而產生作用,因此被命名為piwi-interacting RNA,簡稱piRNA[4-7].自piRNA被發現以來,研究人員對其研究進展迅速,現已發現其在生殖干細胞分化、胚胎發育、維持DNA完整性、表觀遺傳學調控和物種的性別決定等方面起著重要作用[8-12].迄今許多與腫瘤相關的piRNA仍不為人所知,有關其表達調節的研究也不多[13].本研究通過小RNA測序及后續的生物信息學技術分析胃癌中的piRNA表達情況,并選取4個piRNA采用莖環RT-qPCR技術驗證其在胃癌組織與正常組織中表達的差異性,為今后研究piRNA在胃癌發病中的作用提供一定的研究基礎.

1 材料和方法

1.1 實驗材料 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;M-MLV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs、SYBR Green I Mastermix等試劑購自中國臺灣Toyobo公司;引物由上海英駿生物技術有限公司合成.

1.2 方法

1.2.1 標本采集:選取2010年至2011年間在溫州醫科大學附屬第一醫院胃腸外科手術治療的31例胃癌患者的胃癌組織及距癌組織邊緣5 cm以上的配對癌旁正常胃黏膜組織(經病理確定不含癌細胞),全部病例術前均未經過放療、化療等治療.31例胃癌患者中,男26例,女5例,年齡48~83歲,中位年齡62歲,其中≥60歲19例,<60歲12例;胃癌臨床分期I期3例,II期0例,III期19例,IV期9例;有淋巴結轉移27例,無淋巴結轉移4例.所有組織標本取出后10 min內置于液氮中保存,于液氮中放置24 h后再放入-80 ℃冰箱保存.本研究經溫州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會審核通過,所有患者均知情同意.

1.2.2 RNA的提取:按Trizol試劑說明書提取總RNA,異丙醇沉淀時間為-20 ℃放置2 h以上以增加小RNA提取率.用80%乙醇沖洗,DEPC處理過的蒸餾水溶解并保存于-80 ℃冰箱中.采用德國EPPENDORF公司的分光光度儀檢測RNA溶液,即OD260和OD280,OD260/OD280比值>1.8為符合實驗要求的RNA濃度和純度.1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA完整性.

1.2.3 胃癌相關piRNA篩選:選取RNA完整性佳的3例標本(均包括胃癌組織和正常胃黏膜組織)各1份送華大基因研究中心進行小分子RNA(small RNA,sRNA)深度測序,對測序所得的35 nt原始reads做去接頭、去低質量reads、去污染等處理,得到高質量的測序reads.選取美國國立生物技術信息中心(national center for biotechnology,NCBI)中的piRNA序列對測序所得的sRNA序列進行注釋,經過數據統計,挑選出匹配上piRNA的sRNA序列.

1.2.4 莖環RT-qPCR檢測piRNA:采用莖環RT-qPCR方法[14],以U6為內參,分析各piRNA的表達.相關引物序列見表1.4 μg總RNA分別以4個piRNA及U6莖環RT-qPCR引物進行反轉錄,反應條件為:16 ℃30 min,42 ℃ 30 min,70 ℃ 15 min,反應產物于-20 ℃保存.以20 μL體系進行RT-qPCR.piRNA的檢測反應體系包括:1 μL RT產物、1XSYBR Green I Mastermix、10 μmol/L piRNA特異前向引物、10 μmol/L通用的反向引物.RT-qPCR的反應條件:95 ℃ 2 min后,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40個循環.RT-qPCR使用Applied Biosystems 7500儀器進行.所有樣品做3復孔,記錄每個反應孔中熒光信號到達所設定的閾值時所經歷的循環數(即Ct值).以U6為內參,采用RT-qPCR中的相對定量法,以N=2-ΔΔCt表示胃癌組織相對配對正常組織表達的倍數

1.3 統計學處理方法 采用SPSS16.0統計軟件進行統計分析.正常胃黏膜組織和胃癌組織piRNA與NCBI比對的結果采用Mann-Whitney U檢驗.piRNA的RT-qPCR檢測結果以M(P25,P75)表示,2組間比較采用Mann-Whitney U檢驗.P<0.05為差異有統計學意義.

2 結果

2.1 胃癌組織piRNA差異表達分析 Solexa深度測序所得序列長度分布見圖1.與正常胃黏膜組織比較,長度約30 nt的sRNA在胃癌組織中呈減少趨勢.采用生物信息學對測序獲得的sRNA進行分類注釋,確定piRNA的種類及數量(見表2).從表2可以看出正常胃黏膜與胃癌組織中測得的piRNA種類在各標本所測得的所有sRNA種類中所占的比例差異無統計學意義(Z=0.835,P=0.678);而正常胃黏膜組織中測得的piRNA數量與各標本所測得所有sRNA序列總讀數的比例顯著高于胃癌組織,差異有統計學意義(Z=2.167,P=0.042).在此基礎上,選取4個reads豐度大于10 000,在胃癌組織與相應正常胃黏膜組織中reads數相差3倍以上的piRNA(登錄號分別為DQ570956、DQ575659、DQ594126、DQ597128)進一步驗證.

表1 莖環RT-qPCR引物序列

圖1 sRNA片段測序長度分布圖

表2 正常胃黏膜組織和胃癌組織piRNA與NCBI比對的檢測結果

2.2 胃癌組織差異表達piRNA驗證 我們采用TANG等[15]建立的莖環RT-qPCR分析piRNA.所選的4種piRNA(DQ570956、DQ575659、DQ594126、DQ597128)及U6 RT-qPCR擴增產物的溶解曲線均顯示為單峰(見圖2).4種piRNA在胃癌組織中的相對表達量分別為0.28(0.12,0.85)、0.28(0.02,0.70)、0.56(0.29,1.11)、0.30(0.13,0.84),表明其在胃癌組織中的相對表達量均顯著低于正常胃黏膜組織,差異均有統計學意義(P<0.05).

圖2 莖環RT-qPCR擴增產物的溶解曲線

3 討論

近年來,小分子非編碼RNA因其在轉錄及轉錄后水平對基因表達的有力調節而被廣泛研究[16-18].特別是非編碼小RNA中的siRNA和miRNA已經被證明參與了腫瘤的發生和進展過程[19-21].研究表明,非編碼小RNA在多種腫瘤中具有潛在的診斷價值,并且可以作為備選的治療靶點[10,22].

piRNA是一類新型小分子非編碼RNA,自2006年7月被發現以來,相繼有4個獨立的實驗室從鼠睪丸里面分離得到piRNA[1-4].目前發現piRNA主要在生殖細胞中表達,在基因表達的調控和干細胞的分化中充當著重要的作用[23].其生物學功能主要是維持基因組中轉座子的正常沉默狀態,以防止基因組中轉座子爆發而引起相應基因的改變[6,13].近來各研究顯示piRNA可能在更大范圍的生物學過程中發揮重要影響.如WONG等[23]與CARMELL等[24]研究發現蠅類piRNA突變引起的反轉錄轉座子的過表達和作用可以導致生殖系DNA的損傷;ESPOSITO等[25]研究證實piR-015520在人組織中表達并能夠抑制褪黑素受體1A(MTNR1A)基因的表達;ASHRAF等[26]研究發現參與piRNA生產的蛋白與體細胞基因表達的控制及學習記憶相關.此外,piRNA的生物學起源與作用機制并未完全明確,比如尚不明確piRNA主要通過控制染色質組織、基因轉錄、RNA穩定還是RNA翻譯來發揮作用.

在人類中,與piRNA相互作用的蛋白質是PiWi蛋白.PiWi蛋白是最早發現的調控干細胞增殖的蛋白之一,其過高表達將引起干細胞過度增長及分裂加速,并在多個物種中通過與PiWi介導的piRNA相互作用以調控基因表達[27].先前研究人員認為piRNA僅僅存在于生殖細胞中[5].最近的研究發現,piRNA在人類腫瘤細胞中也存在,并且通過大規模平行測序技術在人類宮頸癌細胞中得到了鑒定[8].另外,已經有研究證實piRNA水平的改變能夠明顯地增加男性胰腺癌患者的死亡風險[29].這一系列的發現說明,探尋piRNA在人類腫瘤發生中可能的機制是有十分有必要的.

腫瘤已經被廣泛地認為是一類干細胞疾病[30].腫瘤細胞和干細胞一樣擁有自我更新的能力[31].PiWi基因家族是多種生物體中干細胞自我更新的關鍵基因.已有研究證明,HiWi基因作為人類PiWi基因家族的成員之一,參與了生殖細胞的增殖過程,HiWi基因的異常表達與軟組織肉瘤的發生相關[31].人類PiWi基因家族的另外一個成員Hili則發揮著癌基因的作用,明顯地抑制了逆轉座子line-1的表達[28].有研究證實,Hili基因參與了胃癌的發生過程并且可以作為生物治療的潛在作用靶點[32].目前,與腫瘤相關的piRNAs少有研究,其在胃癌中的研究更是罕見.為分析piRNA在人胃癌中的表達情況,本研究采用Solexa測序技術對胃癌和正常胃黏膜組織進行siRNA深度測序,通過生物信息學分析了解piRNA表達情況.結果顯示,胃癌組織中piRNA的種類占所測組織全部sRNA種類的比例較正常組織無明顯差異;但在表達的總體數量上明顯少于正常組織,提示piRNA表達量的減少可能與胃癌的發生密切相關.之后,我們采用莖環RT-qPCR分析piRNA,選取4種piRNA(DQ570956、DQ575659、DQ594126、DQ597128)經莖環RT-qPCR技術檢測其在31例標本中的表達情況,RT-qPCR擴增產物的溶解曲線均顯示為單峰,說明莖環RT-qPCR能擴增相應的目的基因,與對應正常胃黏膜組織比較,各piRNA在31例胃癌組織和對應正常胃黏膜組織中的表達量存在顯著性差異,進一步證實piRNA在胃癌組織中低表達.與正常胃黏膜比較,piRNA在胃癌組織中存在明顯差異表達.4種piRNA經驗證表達量在胃癌組織中呈下調趨勢,考慮到piRNA控制轉座子的正常沉默狀態這一功能,提示了其可能作為一種抑癌因素存在.其在胃癌發生、發展中的具體作用及確切機制有待深入研究.相信隨著今后對有關研究的深入,可為進一步闡明piRNA在胃癌發生、發展(包括腫瘤的藥物治療和分子靶向療法)提供新的著眼點.

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(本文編輯:賈建敏)

Comparison of the expression of piRNA in gastric carcinoma and normal gastric mucosa tissues

JIANG Peipei1, CAI Yiqi1, WANG Pengfei1, CHEN Xiaodong1, JIN Jinji1, HU Changyuan1, CHEN Wenjing1,XUE Xiangyang2, ZHANG Lifang2, ZHU Guanbao1.
1.Department of Gastroenterological Surgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Instiute of Molecular Virology and Immunology, Department of Medical Microbiology and Immunology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective:To analyze the differences of expression of piRNA in gastric carcinoma and normal gastric mucosa.Methods:The small RNA (sRNA) deep sequencing of gastric cancer tissue and normal gastric mucosa was performed by a new generation of high throughput sequencing technology, and the differential expression of piRNA was detected in gastric cancer tissue and normal gastric mucosa by follow-up bioinformatics.Four kinds of piRNAs (login ID: DQ570956, DQ575659, DQ594126 and DQ597128) were selected according to the results of the analysis, and their presence and their differences in gastric cancer tissues and normal gastric mucosa were verified by real-time quantitative PCR.Results:Solexa depth sequencing results showed that there was no significant difference in the proportion of sRNA measured in normal gastric mucosa and gastric cancer tissues (Z=0.835, P=0.678). The number of piRNAs measured in normal tissues was significantly higher than that in gastric cancer tissues (Z=2.167, P=0.042). Four piRNAs were selected according to the analysis results. The expression of that 4 piRNA in gastric cancer tissues was significantly lower in normal gastric mucosa (P<0.05).Conclusion:There are many differentially expressed piRNAs in gastric cancer tissues, and there is significant difference in the normal gastric mucosa. In this study, four piRNAs may be involved in the development and progression of gastric cancer, and the subsequent development of piRNA and gastric cancer of the pathogenesis of the study to provide experimental basis.

stomach neoplasms; piRNA; small RNA; polymerase chain reaction

R392.7

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.10.002

2017-03-18

國家自然科學基金資助項目(81372447);浙江省自然科學基金資助項目(Y2100660);溫州市科技局科研基金資助項目(H20100028).

蔣佩佩(1986-),女,浙江永嘉人,住院醫師,碩士.

朱冠保,教授,Email:zgbwmc@126.com.