探討卵巢漿液性癌組織中Rap1蛋白表達及其在漿液性癌細胞增殖中的作用

侯祥位+陳立俠

【摘要】 目的：探討Rap1蛋白卵巢漿液性癌組織中的表達及其在漿液性癌細胞增殖中的作用。方法：對筆者所在醫院2015年4月-2017年4月手術切除的卵巢標本資料實施統計分析，其中20份為漿液性卵巢癌組織標本，良性腫瘤組織標本10份。另對同期手術切除的正常卵巢組織標本10份的臨床資料進行統計分析，進行細胞培養、Western blot檢測，設計siRNA靶序列，構建靶向Rap1 的siRNA 真核表達載體，建立SKOV3-Rap1-RNAi穩定轉染細胞株，進行MTT實驗，然后對卵巢漿液性癌、良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達、SKOV3細胞增殖受Rap1基因下調的影響進行分析。結果：卵巢漿液性癌組織中Rap1蛋白表達線顯著高于良性腫瘤、正常卵巢組織，差異有統計學意義（P<0.05），但良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達比較差異無統計學意義（P>0.05）；Rap1組細胞的增殖速度顯著高于Empty、WT、NT.Cont組細胞，差異有統計學意義（P<0.05），但Empty、WT、NT.Cont組細胞的增殖速度比較差異無統計學意義（P>0.05）。結論：卵巢漿液性癌組織中Rap1蛋白表達較高，其會對漿液性癌細胞增殖進行抑制。

【關鍵詞】 卵巢漿液性癌組織； Rap1蛋白表達； 漿液性癌細胞增殖； 作用

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.25.028 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2017）25-0055-02

為了將漿液性癌細胞增殖中Rap1蛋白表達的作用闡明，本研究對卵巢漿液性癌、良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達進行了比較，同時將Rap1 shRNA真核表達載體構建了起來，在此過程中將RNA干擾技術充分利用了起來，并建立了SKOV3-Rap1-RNAi穩定轉染細胞株篩選，對SKOV3 細胞增殖能力（Rap1表達缺失）的變化進行檢測，在此過程中運用MTT法，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

對筆者所在醫院2015年4月-2017年4月手術切除的卵巢標本的臨床資料進行統計分析，納入標準：所有患者均具有完整的臨床病歷資料。排除標準：將合并其他系統惡性腫瘤、術前接受放化療治療等卵巢癌患者排除在外。其中20份為液性卵巢癌組織標本，良性腫瘤組織標本10份。另對同期手術切除的正常卵巢組織標本10份的臨床資料進行統計分析，所有標本均以子宮肌瘤為原發病。切除離體后的標本第一時間放置在液氮中保存備用。病理科醫師閱片對所有標本的病理診斷進行證實。采用筆者所在醫院實驗研究中心提供的感受態宿主菌大腸桿菌DH-5α，購買美國Oligo-engine公司生產的pSUPER.retro.neo/GFP（Empty）真核表達載體，GFP、Neo、Amp分別為綠色熒光標記、真核篩選基因（G418）、氨芐抗性基因。EcoRⅠ、BglⅡ、HindⅢ為酶切位點，含H1啟動子。購買重慶醫科大學病理學教研室提供的卵巢漿液性囊腺癌細胞株SKOV3。本課題組在前期工作中已經將陰性質粒（NT）、空載體（Empty）建立了起來。購買寶生物工程（大連） 有限公司生產的限制性內切酶EcoRⅠ、BglⅡ、HindⅢ、兔抗Rap1單克隆抗體，美國Invitrogen公司生產的脂質體LipofectamineTM2000，美國Progema公司生產的T4DNA連接酶，HyClone公司生產的胎牛血清、RPM1640培養基。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 常規培養SKOV3-Rap1-RNAi 穩定轉染細胞株（Rap1i-1）、SKOV3細胞野生型（WT）、陰性質粒（NT.cont）、空載體（Empty）轉染細胞株，位置為RPM1640培養基，實驗細胞呈對數生長[1]。

1.2.2 Western blot檢測 將總蛋白提取出來，途徑為對各組組織及細胞進行裂解，然后對蛋白濃度進行測定，然后進行聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）前將60μg總蛋白從每個上樣孔取出來，轉膜，ECI顯色前孵育，孵育過程中將抗體充分利用起來。成像過程中將凝膠成像儀充分利用起來，然后將各組蛋白條帶的灰度值計算出來，計算過程中將Quantity One圖像分析軟件充分利用起來。蛋白相對表達量=蛋白條帶的灰度值/內參灰度值[2]。

1.2.3 設計siRNA靶序列 對人Rap1基因全序列（NM_001010935.1）全長序列進行檢索，檢索過程中將GenBank充分利用起來，將3對Rap1 siRNA序列設計出來，Rap1 shRNA1基因序列為5-GATCCCCTGCCAACAGTGTATGCTCGTTCAAGAGACGAGCATACACTGTTGGCATTTTTGGAAA-3，Rapl shRNA2基因序列為5-GATCCCCGATGAGCGAGTAGTTGGCATTCAAGAGATGCC-AACTACTCGCTCATCTTTTTGGAAA-3，Rapl shRNA3基因序列為5GATCCCCAGTGGTGTAACTGTGCCTTTTCAAGAGAAAGGCACAGTTACACCACTTTTTTGGAAA-3。其含19 nt，設計過程中將Oligoengine RNAi設計軟件充分利用起來，并對siRNA設計原則進行嚴格遵循，合成主體為invitrogen[3]。

1.2.4 構建靶向Rap1 的siRNA 真核表達載體 將正義鏈、反義鏈退火，其由化學合成，將良好的前提條件提供給shRNA表達模板的形成，連接pSUPER.retro.neo/GFP 質粒，其經BglⅡ、HindⅢ雙酶切后線性化，然后向感受態宿主菌大腸桿菌DH-5α轉化，將質粒提取出來，雙酶切重組質粒，在此過程中將限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ充分利用起來，37 ℃水浴4 h，之后電泳分析，在此過程中將1%瓊脂糖凝膠充分利用起來。向invitrogen送往進行DNA測序鑒定前保證質粒經雙酶切鑒定成功[4]。endprint

1.2.5 建立SKOV3-Rap1-RNAi穩定轉染細胞株 將對數生長期的SKOV3細胞取出來，細胞滿意度達70%～80%后轉染，同時將多個單克隆細胞篩選制備出來，在此過程中將G418充分利用起來，進一步擴大培養，將Rap1具有最顯著沉默效果的穩定轉染細胞株篩選出來前將總蛋白提取出來，在此過程中將免疫印跡篩選出來[5]。

1.2.6 MTT試驗 將200 μl細胞懸液取出來，有2000個細胞存在于每孔，向96孔板中對細胞進行接種，每組5個復孔，同時將空白孔設立出來調零，共將7個培養板接種出來，在孵箱中放置進行常規培養。接種細胞，一周內每天取1個96孔板，加入20μl的5mg/ml 噻唑藍（MTT）溶液，在細胞培養箱中繼續放置進行4 h的孵育，將培養終止，將孔內細胞培養上清液小心吸棄，在此過程中將1 ml注射器充分利用起來。將150 μl二甲亞砜（DMSO）再加入到每孔中，進行10 min的振蕩，對結晶物進行充分溶解。將570 nm波長選取出來，對各孔光密度值進行測定，位置為酶標儀，并將結果詳細記錄下來，將縱坐標設定為光密度值，將橫坐標設定為時間，將細胞生長曲線繪制出來[6]。

1.3 統計學處理

采用SPSS17.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢漿液性癌、良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達比較

卵巢漿液性癌組織中Rap1蛋白表達為（1.190±0.062）%，顯著高于良性腫瘤、正常卵巢組織的（0.613±0.080）%、（0.402±0.052）%，差異有統計學意義（P<0.05），但良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達比較差異無統計學意義（P>0.05），具體見圖1。

2.2 SKOV3細胞增殖受Rap1基因下調的影響

Rap1組細胞的增殖速度為（1.5±0.2），顯著高于Empty、WT、NT.Cont組細胞的0、（1.0±0.2）、（0.9±0.1），差異有統計學意義（P<0.05），但Empty、WT、NT.Cont組細胞的增殖速度比較差異無統計學意義（P>0.05），見圖2。

3 討論

在婦科惡性腫瘤病死率中，卵巢癌位居首位，對婦女的健康及生命造成了嚴重威脅[7]。在腫瘤的浸潤及轉移中，腫瘤細胞內的各種信號通路發揮著不同的作用，Rap1屬于類Ras家族成員，是一種分子開關，在細胞增殖、形態發生等多種信號通路中參與對其進行調節[8]。相關醫學研究表明，Rapl活性一旦失調，惡性腫瘤就會發生發展，同時Rapl有細胞特異性功能，比如，對NIH3T3細胞及星形膠質細胞（Ras轉染）增殖進行抑制，但是卻為Swiss3T3細胞DNA合成提供良好的前提條件，促進細胞增殖速度的加快[9-11]。本研究結果表明，卵巢漿液性癌組織中Rap1蛋白表達線顯著高于良性腫瘤、正常卵巢組織，差異有統計學意義（P<0.05），但良性腫瘤、正常卵巢組織中Rap1蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05）；Rap1組細胞的增殖速度顯著高于Empty、WT、NT.Cont組細胞，差異有統計學意義（P<0.05），說明Rap1蛋白卵巢漿液性癌組織中的表達較高，其會抑制漿液性癌細胞增殖，值得臨床充分重視。

參考文獻

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（收稿日期：2017-05-15）endprint