microRNA-192在晚期糖基化終產物誘導人腹膜間皮細胞上皮-間葉轉化中的作用

邵維斌, 路 萍, 夏春英, 李 忻, 荀 康, 馮松濤, 趙 倩

(江蘇省鎮江市第一人民醫院 腎臟內科, 江蘇 鎮江, 212002)

microRNA-192在晚期糖基化終產物誘導人腹膜間皮細胞上皮-間葉轉化中的作用

邵維斌, 路 萍, 夏春英, 李 忻, 荀 康, 馮松濤, 趙 倩

(江蘇省鎮江市第一人民醫院 腎臟內科, 江蘇 鎮江, 212002)

目的探討microRNA-192(miR-192)對晚期糖基化終產物(AGEs)誘導人腹膜間皮細胞上皮-間葉轉化(EMT)的調控作用。方法人腹膜間皮細胞、轉染miR-192抑制物后人腹膜間皮細胞和轉染miR-192抑制物陰性對照的人腹膜間皮細胞在含AGEs的培養基培養72 h， 以M199培養基和含80 mM BSA的M199培養基為對照，然后運用實時熒光定量PCR法檢測miR-192和mRNA的表達情況，運用蛋白質印跡法檢測蛋白的表達情況。結果在AGEs刺激后，人腹膜間皮細胞miR-192、膠原蛋白I(CollagenI)mRNA、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)mRNA和蛋白表達水平顯著上升 (P<0.05)，而E-鈣黏蛋白(E-cadherin) mRNA和蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)。與轉染miR-192抑制物陰性對照的人腹膜間皮細胞相比，轉染miR-192抑制物的人腹膜間皮細胞miR-192、Collagen I mRNA、α-SMAmRNA和蛋白表達水平顯著下降 (P<0.05)，而E-cadherin mRNA和蛋白表達水平顯著上升(P<0.05)。結論AGEs可能通過上調miR-192表達誘導人腹膜間皮細胞EMT。miR-192抑物可能通過下調miR-192表達阻止AGEs誘導人腹膜間皮細胞EMT。miR-192在AGEs誘導人腹膜間皮細胞EMT中起重要調控作用。

晚期糖基化終產物; 間皮細胞; 上皮-間葉轉化; microRNA-192

隨著腹膜透析的進行，腹膜會出現新生血管和纖維化等結構改變，引起腹膜功能衰竭[1-2]。透析液中高濃度葡萄糖、AGEs等可引起腹膜間皮細胞E-鈣黏蛋白等表達下降, α-平滑肌肌動蛋白等表達上升，發生EMT[3-4], 腹膜間皮細胞EMT可能在腹膜發生新生血管形成和纖維化等結構改變的過程中起主導作用[4-5]。MicroRNA是一類非編碼小RNA, 參與多種疾病調控。研究[6-7]發現, microRNA-192在糖尿病腎組織細胞轉分化和纖維化過程中起重要調控作用。本研究探討microRNA-192在AGEs誘導人腹膜間皮細胞EMT中的調控作用，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 原代人腹膜間皮細胞的培養

人腹膜間皮細胞分離、培養及鑒定參照文獻[8]的方法進行。

1.2 分組

① 對照組, M199培養基; ② AGEs, 含80 mM AGEs-BSA的M199培養基; ③ 牛血清白蛋白(BSA)組，含80 mM BSA的M199培養基。第3代人腹膜間皮細胞在上述各組培養基中培養72 h; ④ miR-192抑制物組，轉染miR-192抑制物的腹膜間皮細胞，在含80 mM AGEs-BSA的M199培養基培養72 h; ⑤ miR-192抑制物對照組，轉染陰性對照的人腹膜間皮細胞在含80 mM AGEs-BSA的M199培養基72 h。

1.3 實時熒光定量PCR法檢測miRNA-192和

E-cadherin mRNA、α-SMA mRNA、Collagen

I mRNA的表達情況

細胞總RNA抽提按Trizol試劑盒的方法進行，轉錄按照cDNA逆轉錄試劑盒說明書進行，運用實時定量PCR試劑盒檢測，按公式2-△△Ct求出基因表達量[9]。E-cadherin、-SMA、CollagenI、miRNA-192引物序列及相關條件見文獻[7, 10]。

1.4 蛋白質印跡法檢測E-cadherin、α-SMA蛋白

的表達[10]

人腹膜間皮細胞裂解蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳后電轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入小鼠抗E-cadherin抗體(美國BD)、小鼠抗α-SMA抗體和小鼠抗β-actin抗體4 ℃過夜，洗膜后加辣根過氧化酶標記的人抗小鼠IgG抗體, 37 ℃1.5 h, 洗膜后加ECL試劑, X線自顯影顯示結果。

1.5 抑制物的合成與轉染

miR-192抑制物，序列為5-GGCUGUCAAUUCAUAGGUCAG-3(購自上海吉瑪生物公司)，抑制陰性對照寡核苷酸，序列為5″-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3(購自上海吉瑪生物公司)。按照試劑說明書進行轉染操作。

1.6 統計學方法

各組間資料比較用方差分析，兩兩比較用Student-Newman-Keals 檢驗(運用SAS軟件進行統計分析)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 AGEs對人腹膜間皮細胞microRNA-192、α-SMA、E-cadherin、和Collagen I mRNA表達的影響

實時定量PCR檢測結果顯示，與對照組及BSA組相比, AGEs刺激72 h后, microRNA-192、Collagen I和α-SMA mRNA的表達水平顯著上升(P<0.05), 而E-cadherin mRNA表達水平顯著下降(P<0.05)。見圖1。

與對照組及BSA組相比，#P<0．05。圖1 AGEs刺激后間皮細胞E?cadherin、α?SMA、CollagenImRNA和microRNA?192的相對表達情況

2.2 AGEs對人腹膜間皮細胞α-SMA、E-cadherin蛋白表達的影響

蛋白質印跡法結果顯示，與對照組及BSA組相比, AGEs刺激72 h后, α-SMA蛋白表達水平顯著增加(P<0.05), 而E-cadherin 蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)。見圖2。

與對照組及BSA組相比，#P<0．05。圖2 AGEs刺激后間皮細胞組α?SMA、E?cadherin蛋白的相對表達情況

2.3 microRNA-192抑制物對在AGEs刺激后人腹膜間皮細胞E-cadherin、α-SMA、CollagenI mRNA、microRNA-192表達的影響

實時定量PCR檢測結果顯示，與miR-192抑制物對照組相比, microRNA-192抑制物轉染后人腹膜間皮細胞在AGEs刺激72 h后, microRNA-192、Collagen I mRNA、α-SMA表達水平顯著下降(P<0.05)，而E-cadherin mRNA表達水平顯著上升(P<0.05)。見圖3。

與miR?192抑制物對照組及AGEs組相比，#P<0．05。圖3 miR?192抑制物作用后間皮細胞E-cadherin、α?SMA、CollagenImRNA和microRNA?192的表達情況

2.4 microRNA-192抑制物對在AGEs刺激后人

腹膜間皮細胞α-SMA、E-cadherin蛋白表達的影響

Western 印跡結果顯示，與miR-192抑制物對照組相比, microRNA-192抑制物轉染后人腹膜間皮細胞在AGEs刺激72 h后, α-SMA蛋白表達水平顯著下降(P<0.05), 而E-cadherin 蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)。見圖4。

3 討 論

腹膜透析已成為終末期腎衰患者主要的治療措施之一。目前，越來越多終末期腎衰患者首選腹膜透析療法。隨著腹膜透析進行，透析液中高濃度葡萄糖、AGEs、葡萄糖降解產物等可引起腹膜結構和功能改變，導致腹膜纖維化和功能衰竭，妨礙了腹膜透析的正常進行。

與miR?192抑制物對照組及AGEs組相比，#P<0．05。圖4 miR?192抑制物作用后間皮細胞組α?SMA、E?cadherin蛋白的表達情況

長期腹膜透析患者腹膜出現表層間皮細胞消失、纖維化、透明樣血管病變及大量新生血管形成等病理改變。腹膜明顯新生血管形成和纖維化是引起腹膜功能衰竭的主要原因。作者先前的研究發現，高濃度葡萄糖或AGEs等能刺激腹膜間皮細胞轉分化[10-11], 發生EMT的腹膜間皮細胞可能是腹膜透析患者腹膜組織中肌纖維母細胞的主要來源之一[4, 12]。這些轉分化的腹膜間皮細胞能產生多種細胞因子如血管內皮生長因子、轉化生長因子β等細胞因子具有促進血管內皮細胞增殖，刺激體內新血管形成、調節組織分化和參與纖維化等作用，腹膜間皮細胞EMT可能在腹膜新生血管形成和纖維化的過程中起關鍵作用。這些證據提示腹膜間皮細胞損傷在腹膜透析時腹膜結構和功能改變中起主導作用。因而研究AGEs損傷腹膜間皮細胞的機制對防治腹膜透析時腹膜結構改變和功能衰竭具有重要意義。

MicroRNA是一類內生的、長度約為20～24個核苷酸的功能性非編碼小RNA，廣泛參與生長發育、細胞分化、細胞凋亡、腫瘤發生等過程[13], 與多種疾病相關[14-16]。最近有研究發現, MicroRNA-192在糖尿病腎組織細胞轉分化和纖維化過程中起重要調控作用，但MicroRNA-192對于AGEs引起腹膜間皮細胞EMT過程中是否同樣具有調控作用，目前尚不清楚。

本研究發現, AGEs刺激后，人腹膜間皮細胞miR-192、Collagen I mRNA、α-SMA mRNA和α-SMA蛋白表達水平明顯上升，而E-cadherin mRNA和E-cadherin蛋白表達水平顯著下降，表明AGEs可能通過上調miR-192表達誘導人腹膜間皮細胞EMT。本研究還發現，轉染miR-192抑制物的人腹膜間皮細胞經AGEs刺激后miR-192、Collagen I mRNA、α-SMA mRNA和α-SMA蛋白表達水平顯著下降，而E-cadherin mRNA和E-cadherin蛋白表達水平顯著上升，表明miR-192抑制物可能通過下調miR-192表達阻止AGEs誘導人腹膜間皮細胞EMT。因此miR-192可能在AGEs誘導人腹膜間皮細胞上皮-間葉轉化中起重要調控作用。

[1] Mehrotra R, Devuyst O, Davies S J, et al. The Current State of Peritoneal Dialysis[J]. J Am Soc Nephrol, 2016, 27: 3238-3252.

[2] Devuyst O, Margetts P J, Topley N. The pathophysiology of the peritoneal membrane[J]. J Am Soc Nephrol, 2010, 21: 1077-1085.

[3] Vargha R, Endemann M, Kratochwill K. Ex vivo reversal of in vivo transdifferentiation in mesothelial cells grown from peritoneal dialysate effluents[J]. Nephrol Dial Transplant, 2006, 21: 2943-2947.

[4] Aroeira L S, Aguilera A, Sánchez-Tomero J A, et al. Epithelial to Mesenchymal Transition and Peritoneal Membrane Failure in Peritoneal Dialysis Patients: Pathologic Significance and Potential Therapeutic Interventions[J]. J Am Soc Nephrol, 2007, 18: 2004-2013.

[5] Yanez-Mo M, Lara-Pezzi E, Selgas R, et al. Peritoneal dialysis and epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells[J]. N Engl J Med, 2003, 348: 403-413.

[6] Putta S, Lanting L, Sun G, et al. Inhibiting microRNA-192 ameliorates renal fibrosis in diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol, 2012, 23: 458-69.

[7] Krupa A, Jenkins R, Luo D D, et al. Loss of MicroRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol, 2010, 21: 438-47.

[8] 邵維斌, 錢家麒. 從網膜組織法培養人腹膜間皮細胞[J]. 腎臟病與透析腎移植雜志, 2001, 10: 92-94.

[9] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method[J]. Methods, 2001, 25: 402-408.

[10] 邵維斌, 荀康, 李忻, 等. 高濃度葡萄糖誘導大鼠腹膜間皮細胞上皮-間葉轉化[J]. 實用臨床醫藥雜志, 2010, 17: 4-7.

[11] 邵維斌, 彭淑娟, 夏春英, 等. 晚期糖基化終產物誘導大鼠腹膜間皮細胞上皮-間葉轉化[J]. 實用臨床醫藥雜志, 2011, 19: 6-9.

[12] Liu Y, Dong Z, Liu H, et al. Transition of mesothelial cell to fibroblast in peritoneal dialysis: EMT, stem cell or bystander[J]. Perit Dial Int, 2015, 35: 14-25.

[13] Adams B D, Parsons C, Walker L, et al. Targeting noncoding RNAs in disease[J]. J Clin Invest, 2017, 127: 761-771.

[14] Ameis D, Khoshgoo N, Iwasiow B M, et al. MicroRNAs in Lung Development and Disease[J]. Paediatr Respir Rev, 2017, 22: 38-43.

[15] Laffont B, Rayner K J. MicroRNAs in the Pathobiology and Therapy of Atherosclerosis[J]. Can J Cardiol, 2017, 33: 313-324.

[16] Oliveto S, Mancino M, Manfrini N, et al. Role of microRNAs in translation regulation and cancer[J]. World J Biol Chem, 2017, 8: 45-56.

TheroleofmicroRNA-192inprogressionofadvancedglycationendproducts-inducedepithelial-to-mesenchymaltransitionofhumanperitonealmesothelialcells

SHAOWeibin,LUPing,XIAChunying,LIXin,XUNKang,FENGSongtao,ZHAOQian

(DepartmentofNephrology,ZhenjiangFirstPeople′sHospital,Zhenjiang,Jiangsu, 212002)

ObjectiveTo investigate the role of microRNA-192 (miR-192) in the regulation of epithelial mesenchymal transition induced by advanced glycation end products (AGEs) in human peritoneal mesothelial cells.MethodsThe human peritoneal mesothelial cells, the human peritoneal mesothelial cells transfected by miR-192 inhibitor and the human peritoneal mesothelial cells transfected by miR-192 inhibitor negative control were cultured for 72 hours in culture medium containing AGEs (80mM); M199 medium and medium with M199 medium containing 80mM BSA as negative control, the expression of miR-192 and mRNA was detected by real-time quantitative PCR, and the expression of miR-192 and mRNA was detected by Western blotting.ResultsAGEs significantly upregulated the expression of miR-192, Collagen I mRNA, α-smooth muscle actin(α-SMA) mRNA and protein(P<0.05), while significantly downregulated the E-cadherin mRNA and protein expression(P<0.05). Compared with human peritoneal mesothelial cells transfected by miR-192 inhibitor, the expression of miR-192 and Collagen I mRNA and α-SMA mRNA and protein was decreased (P<0.05), while E-cadherin mRNA and protein expression was significantly increased (P<0.05).ConclusionAGEs may induce EMT of human peritoneal mesothelial cells by upregulation of miR-192 expression. MiR-192 inhibitor may prevent AGEs-inducing EMT of human peritoneal mesothelial cells by down-regulation of miR-192 expression, and may play an important regulatory role in EMT of human peritoneal mesothelial cells induced by AGEs.

peritoneal mesothelial cells; epithelial-to-mesenchymal transition; advanced glycation end products; microRNA-192

R 459.5

A

1672-2353(2017)19-095-04

10.7619/jcmp.201719027

2017-05-21

江蘇省鎮江市科技項目(SH2013051)