CIP2A在鼻咽癌中的表達及其與鼻咽癌臨床病理特征的關系研究

胡信 潘君芬 吳國民

CIP2A在鼻咽癌中的表達及其與鼻咽癌臨床病理特征的關系研究

胡信 潘君芬 吳國民

目的分析蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（CIP2A）在鼻咽癌組織中的表達情況，并探討其與鼻咽癌臨床病理特征的關系。方法 選取鼻咽癌病理標本70例，另擇正常鼻咽部組織30例作為對照。采用免疫組化法檢測CIP2A蛋白表達情況，采用RT-PCR法檢測CIP2A mRNA表達情況。觀察并比較CIP2A蛋白、mRNA在鼻咽癌及鼻咽部正常組織中的表達情況；分析CIP2A mRNA表達水平與鼻咽癌臨床病理特征的關系。結果 鼻咽癌組織中CIP2A蛋白、mRNA陽性表達率均高于鼻咽部正常組織（65.71%vs 26.67%、81.43%vs 16.67%，均P＜0.05）。CIP2A mRNA表達水平與鼻咽癌患者性別、年齡、病理類型無關（均P＞0.05），而與表示腫瘤范圍的T分期、淋巴結有無轉移的N分期及綜合的臨床分期有關（均P＜0.05）。結論 CIP2A與鼻咽癌的發生和浸潤轉移有關，可作為判斷鼻咽癌惡性程度的一個重要生物學指標。

鼻咽癌 CIP2A 免疫組化 RT-PCR

鼻咽癌是我國，尤其是長江以南地區的一種高發惡性腫瘤，其發病率居于耳鼻咽喉科惡性腫瘤首位。鼻咽癌的發病機制目前尚未明確，以往的研究表明其發生是EB病毒感染、遺傳易感性、環境致癌物等多種因素共同作用的結果。蛋白磷酸酶2A（PP2A）的癌性抑制因子（CIP2A）是一種內源性蛋白，可通過與癌轉錄因子c-Myc直接結合，在分子水平對PP2A起到抑制作用，進一步抑制c-Myc蛋白水解，可能在促進細胞增殖和惡性轉化、維持細胞的惡性表型方面起重要作用[1]。研究表明，CIP2A在許多惡性腫瘤中高表達，如結腸癌[2]、胃癌[3]、非小細胞肺癌[4]、乳腺癌[5]等，但其在鼻咽癌中的表達情況報道少見。本研究采用RT-PCR、免疫組化法分析CIP2A在鼻咽癌組織中的表達情況，并探討其與鼻咽癌臨床病理特征的關系，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2010年7月至2013年7月在本院門診行鼻咽部活檢，后確診為鼻咽癌的70例患者的病理標本。所有患者術前均未進行放、化療。其中男64例，女6例；年齡28～72歲，中位年齡57.5歲；未分化型鼻咽癌29例，低分化型鼻咽癌41例；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期各35例。TNM分期T1期25例，T2期26例，T3期13例，T4期 6例；N1期 15例，N2期 22例，N3期 6例，N0期27例；無腫瘤遠處轉移的患者。所有標本均為活檢時即刻獲取的新鮮組織，組織標本在獲取后立即一分為二，其中一份立即轉移至-80℃低溫冰箱中冷凍保存以供RT-PCR檢測時使用，而準備用于免疫組化檢測的另一份標本放入10%甲醛溶液中固定。另擇因鼻咽部局部隆起而行鼻咽部活檢、并病理證實為鼻咽部黏膜慢性炎的30例基本正常鼻咽部組織作為對照。

1.2 主要試劑及RT-PCR引物 CIP2A多克隆抗體（Santa Crus公司）；生物素標記的羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；S-P免疫組化試劑盒以及DAB溶液PBS（pH=7.4）（福州邁新生物科技有限公司）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI1640干粉（Gibco公司）；RNA Fast200總RNA極速提取試劑盒（上海飛捷生物公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉錄試劑盒以及 2×Taq PCR Mastermix（TaKaRa公司）。根據人類CIP2A的cDNA序列，應用Primer軟件設計 PCR引物，上游引物 5′-TACGAATTCATGCGACGGCTGCTGATC-3′，下游引物 5′-TACCTCGAGGGAGAAGGCGAACTGTCCAG-3′，擴增產物共307bp。以β-actin基因表達產物作內參照設計PCR引物，上游引物5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下游引物 5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′，擴增產物共197 bp，由上海生工公司合成。

1.3 方法

1.3.1 CIP2A蛋白表達檢測 采用免疫組化SP法。所有標本經10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，4μm連續切片，用SP法進行免疫組化染色，CIP2A多克隆抗體濃度1∶200，實驗步驟按試劑盒說明書進行，顯微鏡下觀察，成像系統拍照并對陽性結果進行分析。PBS代替一抗作為陰性對照，陽性對照為Santa Cruz公司提供的陽性片。由2位病理科醫師讀片，根據染色強度和陽性細胞百分比綜合結果評估。染色強度評分：（1）陰性：與背景色一致，得 0 分；（2）弱陽性：淡黃色，得 1 分；（3）陽性：黃色，得2分；（4）強陽性：棕黃色，得3分。陽性細胞百分比評分：（1）＜10%，得 0分；（2）11%～25%，得 1分；（3）26%～50%，得 2分；（4）＞50%，得 3分。采用染色強度評分乘以陽性細胞百分比評分的積作判定：＜2分為陰性（-），2～4分為弱陽性（±），5～7分為陽性（+），＞7分為強陽性（++）；除去陰性結果的所有弱陽性、陽性及強陽性視為CIP2A蛋白陽性表達。

1.3.2 CIP2A mRNA表達檢測 采用RT-PCR法進行基因擴增，以2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。鼻咽癌和正常鼻咽部組織中總RNA按Fast200總RNA極速提取試劑盒說明書步驟進行提取，溶于無RNase酶水中，-80℃保存備用。應用PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉錄試劑盒，取1μg總RNA，在10μl體系中以Oligo dT Primer為引物，應用PrimeScriptTMRT Enzyme Mix逆轉錄合成cDNA，合成過程按試劑盒說明書進行。按照2×Taq PCR Mastermix試劑說明配置PCR反應體系，合成所得PCR產物在4℃下保存，然后取PCR擴增產物5μl點樣于20g/L的瓊脂糖凝膠上進行電泳。應用Gene Snap軟件系統分析擴增條帶，未顯示CIP2A基因擴增條帶表示CIP2A mRNA陰性表達，顯示CIP2A基因擴增條帶表示CIP2A mRNA陽性表達；將CIP2A基因與β-actin基因擴增條帶吸光度值的比值（CIP2A/β-actin）計為CIP2A mRNA的相對表達水平。

1.4 觀察指標 觀察并比較CIP2A蛋白、mRNA在鼻咽癌及鼻咽部正常組織中的表達情況；分析CIP2A mRNA表達水平與鼻咽癌臨床病理特征的關系。

1.5 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件；計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以頻數和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CIP2A蛋白在鼻咽癌及鼻咽部正常組織中的表達情況比較 見圖1。

圖1 CIP2A蛋白在鼻咽癌及鼻咽部正常組織中的表達情況（a：鼻咽癌組織；b：鼻咽部正常組織；SP法，×400）

由圖1可見，CIP2A蛋白陽性染色定位于細胞質中，呈棕黃色細小顆粒，也可以呈彌漫分布。鼻咽癌組織中CIP2A蛋白陽性表達率為65.71%（46/70），而鼻咽部正常組織中CIP2A蛋白陽性表達率為26.67%（8/30），兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 CIP2A mRNA在鼻咽癌及鼻咽部正常組織中的表達情況比較 見圖2。

圖2 CIP2A mRNA在鼻咽癌及鼻咽部正常組織中的表達電泳圖（C：鼻咽癌組織；N：正常鼻咽部組織）

由圖2可見，鼻咽癌組織中CIP2A mRNA陽性表達率為81.43%（57/70），鼻咽部正常組織中CIP2A mRNA陽性表達率為16.67%（5/30），兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。鼻咽癌組織中CIP2A mRNA的平均表達水平為0.57，鼻咽部正常組織CIP2A mRNA的平均表達水平為0.11，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。2.3 CIP2A mRNA表達水平與鼻咽癌臨床病理特征的關系 以70例鼻咽癌組織中CIP2A mRNA的平均表達水平（0.57）為界，將其分為高表達組（≥0.57，共46例）及低表達組（＜0.57，共24例）。CIP2A mRNA表達水平與鼻咽癌臨床病理特征的關系見表1。

由表1可見，CIP2A mRNA表達水平與鼻咽癌患者性別、年齡、病理類型無關（均P＞0.05），而與表示腫瘤范圍的T分期、淋巴結有無轉移的N分期及綜合的臨床分期有關（均P＜0.05）。

表1 CIP2AmRNA表達水平與鼻咽癌臨床病理特征的關系[例（%）]

3 討論

CIP2A是一種能夠抑制PP2A活性的蛋白，可以通過抑制PP2A對癌蛋白c-Mycr的脫磷酸化作用，穩定c-Myc蛋白二元磷酸化結構，減少c-Myc蛋白被泛素化水解；同時，作為核轉錄調節因子的c-Myc又能促進CIP2A mRNA的轉錄，從而形成一個正反饋環路[6]。研究發現，在良性組織中，除在骨髓、腦和前列腺等組織中CIP2A mRNA呈中高度表達外，其余組織中表達均較低或無表達[7]。但在許多惡性腫瘤中，如結腸癌[2]、胃癌[3]、非小細胞肺癌[4]以及乳腺癌[5]中CIP2A都高表達，且與腫瘤惡性程度，特別是與腫瘤的浸潤、轉移密切相關，影響患者預后。CIP2A在維持細胞表形轉化，促進細胞增殖和體內腫瘤生長方面起關鍵作用[1]。CIP2A的過度表達可以促進細胞轉化和增殖，阻止細胞衰老[7]。許多研究已經表明癌蛋白c-Myc在許多惡性腫瘤的癌性增生與發展階段起重要作用，并且在癌變后仍持續呈現高表達狀態，是惡性腫瘤浸潤、復發及預后等生物學行為的影響因素[8-12]。而CIP2A通過抑制PP2A而促進c-Myc的表達，因此，推測CIP2A可能和腫瘤的浸潤、復發及預后有關。

本研究應用免疫組化和RT-PCR的方法檢測了CIP2A在鼻咽癌及正常鼻咽部組織中的表達情況。免疫組化結果顯示，在65.71%的鼻咽癌組織中檢測到CIP2A蛋白陽性表達，要明顯高于正常鼻咽部組織中CIP2A蛋白陽性表達（26.67%），兩者差異有統計學意義；同樣，RT-PCR結果也顯示CIP2A mRNA在鼻咽癌組織中的表達明高于正常鼻咽部組織，以上結果提示CIP2A可能與鼻咽癌的發生有關。進一步分析CIP2A的表達與鼻咽癌臨床病理特征的關系發現，在腫瘤原發灶周邊的浸潤轉移中，根據TNM分期中的T分期，級別越高的腫瘤組織中CIP2A表達要高于級別低的；有淋巴結轉移的CIP2A的表達要明顯高于無淋巴結轉移的，而且N分期越高，CIP2A表達也越高；綜合起來按臨床分期比較，Ⅲ～Ⅳ期的鼻咽癌組織CIP2A表達水平也顯著高于Ⅰ～Ⅱ期，差異均有統計學意義；但在不同年齡段、不同性別以及不同病理類型中，CIP2A表達差異無統計學意義。這提示CIP2A可能與鼻咽癌的浸潤、轉移過程有關，是造成鼻咽癌預后不良的因素之一。但CIP2A在鼻咽癌發生、發展中的具體作用機制尚不明確，尚待進一步研究。

綜上所述，CIP2A與鼻咽癌的發生和浸潤轉移有關，可作為判斷鼻咽癌惡性程度的一個重要生物學指標，有望成為腫瘤綜合治療的作用靶點。

[1] Junttila M R,Puustinen P,NiemelM,et al.CIP2A inhibitts PP2A in human malignancies[J].Cell,2007,130(1):51-62.

[3]Khanna A,Bokelman C,Hemmes A,et al.MYC-dependent regulation and prognostic role of CIP2A in gastric caneer[J].J Natl Cancer Inst,2009,101(11):793-805．

[4] 董千澤,王恩華.CIP2A在非小細胞肺癌中過表達并且促進肺癌細胞增殖[C].中華醫學會病理學分會2009年學術年會論文匯編,西安:中華醫學會病理學分會,2009.

[6] 錢安平,辛彥,肖玉平.CIP2A與腫瘤關系的研究進展[J].世界華人消化雜志,2009,17(26):2700-2704．

[7] Li W,Zheng G,Cheng L,et al.CIP2A is overexpressed in gastric cancer and its depletion leads to impaired clono-genicity,senescence,or differentiation oftumor cells[J].Clin Cancer Res,2008,14(12):3722-3728．

[8] Wang X L,Sun L,Wang X J,et al.Acidified bile acids enhance tumor progression and telomerase activity of gastric cancer in mice dependent on c-Myc expression[J].Cancer Medicine,2017,6(4):788-797.

[9] Vita M,Henriksson M.The Myc oncoprotein as a therapeutic targetforhuman cancer[J]．Semin CancerBioi,2006,16(4):318-330.

[10] 秦艷茹,李永欣,王立東,等.食管癌和淋巴結轉移組織中c-Myc,hTERT和c-MET蛋白的表達[J].鄭州大學學報(醫學版),2006,41(1):34-36．

[11] SatoshiK,Shunsuke E,AyumiA,et al.Invasive Fusob-acterium nucleatum activates beta-catenin signaling in colorectal cancervia a TLR4/P-PAK1 cascade[J].Oncotarget,2017,8(19):31802-31824.

[12]ShachafC M,Kopelman AM,ArvanitislC,et al.MYC inacti-vation uncovers pluripotent differentiation and tumour dormancy in hepatocellular cancer[J].Nature,2004,431(7012):1112-1117．

Expression of CIP2A in nasopharyngeal carcinoma and its clinicopathological significance

HU Xin,PAN Junfen,WU Guomin.Department of Otorhinolaryngology,Zhejiang Taizhou Hospital,Taizhou 317000,China

ObjectiveTo investigate the expression of cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A (CIP2A)in nasopharyngeal carcinoma(NPC)and its clinicopathological significance.Methods The expression of CIP2A protein and mRNA in 70 specimens of NPC and 30 specimens of normal nasopharyngeal tissue was detected by immunohistochemistry and RT-PCR,respectively.The correlation between CIP2A expression and clinicopathological features of NPC was analyzed. Results The expression of CIP2A protein and mRNA was higher in NPC than that in normal nasopharyngeal tissue(65.71%vs 26.67%,81.43%vs 16.67%,respectively,both P＜0.05).The expression of CIP2A mRNA was correlated with tumor size,lymph node metastasis and clinic stages of NPC (all P＜0.05),not with the gender,age of the patients and pathological type(P＞0.05).Conclusion CIP2A may be associated with the occurrence,invasion and metastasis of NPC,suggesting that it can be used as an indicator for malignant degree ofnasopharyngealcarcinoma.

Nasopharyngealcarcinoma(NPC) Cancerous inhibitor ofprotein phosphatase 2A(CIP2A) Immunohistochemistry RT-PCR

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.19.2017-1670

317000 浙江省臺州醫院耳鼻咽喉科（胡信、吳國民），病案統計室（潘君芬）

胡信，E-mail：hu0428@126.com

2017-07-13）

（本文編輯：李媚）