microRNA-100在急性髓細胞白血病中的預后評估價值研究

趙明哲 胡慧仙 張素麗 駱超 章敬成

microRNA-100在急性髓細胞白血病中的預后評估價值研究

趙明哲 胡慧仙 張素麗 駱超 章敬成

目的探討骨髓細胞microRNA-100表達水平對急性髓細胞白血?。ˋML）患者的預后評估價值。方法 選取核型正常AML（CN-AML）患者154例，采用熒光定量RT-PCR法檢測骨髓細胞microRNA-100的表達水平，將數值大于等于中位數者歸為高表達組，低于中位數者歸為低表達組。比較microRNA-100高表達組與低表達組患者的臨床特征，包括性別、年齡、FAB分型、Hb、WBC、PLT、原始細胞比例、FLT3-ITD基因突變、NPM1基因突變、化療后完全緩解情況等。隨訪48個月，觀察并比較兩組患者總生存、無事件生存率。結果 與高表達組患者比較，低表達組患者的FAB分型M4、M5型比例較高（P＜0.05），Hb水平較低（P＜0.05），原始細胞比例較低（P＜0.05）。兩組患者性別、年齡、WBC、PLT、FLT3-ITD基因突變、NPM1基因突變、化療后完全緩解情況比較均無統計學意義（均P＞0.05）。microRNA-100低表達組患者總生存率、無事件生存率均低于高表達組患者（均P＜0.05）。結論 microRNA-100低表達或是AML患者預后差的評估指標。

microRNA-100 急性髓細胞白血病 預后

急性髓細胞白血病（AML）是一種異質性的血液系統腫瘤，主要表現為不同的分子特征和臨床預后[1]。隨著分子生物學的發展和基因測序技術的提高，許多與AML預后相關的生物標志物被發現，如FLT3-ITD、NPM1、CEBPA基因突變等[1-2]。microRNA是一種非編碼的小分子RNA，其主要功能是在轉錄后水平調控靶基因的表達，現已經發現許多microRNA對細胞的增殖、分化、凋亡及轉移起著十分重要的作用。對血液系統腫瘤研究發現，microRNA-15/16可通過靶向抑制慢性粒細胞白血病患者Bcl-2基因的表達而參與疾病發生、發展，microRNA-181家族對AML患者預后有評估作用[3]。最近，一項對實體腫瘤的Meta分析提示microRNA-100的低表達與患者的預后差密切相關[4]。本研究通過檢測AML患者骨髓細胞中microRNA-100的表達水平，分析不同表達水平患者的臨床特征，探討該指標對患者預后評估的價值，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2008至2016年本院收治的核型正常AML（CN-AML）患者 154 例，年齡 17～77 歲，中位年齡41歲?；颊呔捎肐A方案化療（伊達比星8～10mg/m2，d1～3，阿糖胞苷 100mg，d1～7），鞏固治療采用3～4 個療程的中劑量阿糖胞苷（2g/m3，2 次 /d，d1～3），患者均未進行骨髓移植。染色體核型采用R帶顯示法檢測，至少20個核型正常視為核型正常患者。采用PCR直接測序法對患者的骨髓細胞進行FLT3-ITD、NPM1基因突變篩查，相關的引物和方法參考文獻[5]。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 熒光定量RT-PCR法檢測microRNA-100的表達于2016年在本院中心實驗室進行。治療開始前采集患者的骨髓細胞，經淋巴細胞分離液分離提取出單個核細胞，按照RNAiso Plus試劑盒說明書（日本Takara公司）操作，抽提出RNA，逆轉錄成cDNA，-80℃保存用于后續分析。RT-PCR反應按照All-in-oneTMmiRNAqRTPCR Detection試劑盒（美國Gene Copoeia公司）進行操作，采用20μl PCR反應體系：逆轉錄反應產物2μl，SYBR Premix Ex Taq 12.5μl，上游及下游引物各 1μl，雙蒸水（ddH2O）補足體系。反應條件：95℃預變性30s，95℃5s，退火溫度60℃30s，所有產物均40個循環。每個樣本重復3次。內參選用U6，ΔCt=microRNA-100的Ct值-U6的Ct值。ΔΔCt=待測樣品ΔCt-參照樣本ΔCt，按2-ΔΔCt值進行microRNA-100的表達水平相對定量。U6的引物序列：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′。microRNA-100的引物序列：5′-AACCCGTAGATCCGAACTTGTG-3′。

1.3 觀察指標 根據microRNA-100的表達水平，將數值大于等于中位數的患者歸為高表達組，低于中位數者歸為低表達組。比較microRNA-100高表達組與低表達組患者的臨床特征，包括性別、年齡、FAB分型、Hb、WBC、PLT、原始細胞比例、FLT3-ITD基因突變、NPM1基因突變、化療后完全緩解情況等。隨訪48個月，分別觀察并比較兩組患者總生存、無事件生存率。

1.4 隨訪 患者治療后每半年電話隨訪1次，隨訪48個月，觀察患者總生存、無事件生存率?？偵嫫诘亩x是指從患者確診CN-AML開始至因任何原因死亡的時間。無事件生存期的定義是指從患者確診CN-AML開始至疾病經治療后無復發及其任何原因引起死亡。

1.5 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件；計量資料以M（P25,P75）表示，兩組比較采用Wilcoxon秩和檢驗；計數資料以頻數和構成比表示，兩組比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法估計兩組患者的生存率并繪制生存曲線，兩組患者生存率的比較采用log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 microRNA-100高表達組與低表達組患者臨床特征比較 154例CN-AML患者microRNA-100的表達水平4.00～13.75，中位數為9.96，高表達組與低表達組患者各77例。兩組患者臨床特征比較見表1。

表1 microRNA-100高表達組與低表達組患者臨床特征比較

由表1可見，與高表達組患者比較，低表達組患者的 FAB 分型 M4、M5型比例較高（P＜0.05），Hb水平較低（P＜0.05），原始細胞比例較低（P＜0.05）。兩組患者性別、年齡、WBC、PLT、FLT3-ITD 基因突變、NPM1基因突變、化療后完全緩解情況比較均無統計學意義（均P ＞0.05）。

2.2 microRNA-100高表達組與低表達組患者臨床預后比較 分別以總生存、無事件生存為終點繪制microRNA-100高表達組與低表達組患者生存曲線，見圖1（插頁）。

由圖1可見，microRNA-100低表達組患者總生存率、無事件生存率均低于高表達組患者（均P＜0.05）。

圖1 microRNA-100高表達組與低表達組患者生存曲線（a：總生存率；b：無事件生存率）

3 討論

microRNA在腫瘤的發生、發展過程中起重要作用，許多microRNA不僅可作為治療的靶點，還可作為檢測診療的生物標志物[3]。目前，在實體瘤中，臨床已經深入研究microRNA-100在腫瘤中發生、發展的作用，結果提示microRNA-100起著抑癌基因的作用[4]。過表達microRNA-100后，可抑制多個癌基因的表達，如在食管癌中，microRNA-100過表達后可直接抑制mTOR和FGFRs的表達，進而抑制腫瘤的增殖[6]；microRNA-100還可以抑制Wnt信號通路，抑制乳腺癌的轉移[7]；在肺癌中，microRNA-100可以抑制HOXA1癌基因的表達[8]。最近一項Meta分析結果表明，microRNA-100低表達的患者預后差[4]。與實體腫瘤相比，microRNA-100在血液系統腫瘤中的研究較少。

本研究探討骨髓細胞microRNA-100表達水平對AML患者的預后評估價值。結果發現，與microRNA-100高表達組患者比較，低表達組患者的FAB分型M4、M5型比例較高，Hb水平較低，原始細胞比例較低。兩組患者性別、年齡、WBC、PLT、FLT3-ITD 基因突變、NPM1 基因突變、化療后完全緩解情況比較均無統計學意義。microRNA-100低表達組患者總生存率、無事件生存率均低于高表達組患者。這說明，microRNA-100的低表達與患者貧血相關，但具體機制目前并不清楚。microRNA-100低表達患者FAB分型M4、M5型比例較高，可能的解釋是 microRNA-100可抑制 FGFRs、HOXA1、Wnt信號通路等癌基因，進而賦予了M4、M5型容易髓外轉移的惡性表型。在AML患者中，和實體瘤一樣，microRNA-100低表達者預后差。

本研究存在一些不足之處，如本研究是單中心研究；沒有檢查其他的高頻基因突變，如TET2、IDH1/2基因突變等；沒有采用細胞或動物模型，在體外驗證microRNA-100低表達提示AML患者預后差的生物學機制。但是，本研究發現microRNA-100低表達與CN-AML患者預后差有關。該結論有助于臨床醫師對CN-AML患者進行危險度分層，同時為研究AML的靶向治療藥物提供靶點。

綜上所述，本研究結果顯示骨髓細胞microRNA-100表達水平可預測AML患者預后，microRNA-100低表達或是AML患者預后差的評估指標。

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[3]Yeh C H,Moles R,Nicot C.Clinical significance of microRNAs in chronic and acute human leukemia[J].Mol Cancer,2016,15(1):18-20.

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[6] Sun J,Chen Z,Tan X,et al.MicroRNA-99a/100 promotes apoptosis by targeting mTOR in human esophageal squamous cellcarcinoma[J].Med Oncol,2013,30(1):411-415.

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Value of miR-100 expression in prognosis of patients with cytogenetically normalacute myeloid leukemia

ZHAO Mingzhe,HU Huixian,ZHANG Suli,et al.Department of Hematology,Jinhua Municipal Central Hospital (Jinhua Hospital of Zhejiang University),Jinhua 321000,China

ObjectiveTo assess the prognostic value of miR-100 expression in patients with cytogenetically normal acute myeloid leukemia(CN-AML).Methods miR-100 expression was detected by real-time quantitative PCR in bone marrow blasts from 154 patients with CN-AML.Patients with miR-100 expression level higher than the median were defined as high expression group.The age,sex,white cells counts(WBC),hemoglobin,platelet counts(PLT)and therapeutic response were compared between high and low expression groups.The overall survival(OS)and event free survival(EFS)were analyzed after 48 months of follow-up. Results Patients with low miR-100 expression had lower hemoglobin and lower percentage of blasts,but higher frequency of FAB M4/5 subtypes.There were no significant differences in age,sex,WBC and PLT,FLT3-ITD and NPM1 gene mutations and complete remission rate between high and low expression groups.Patients with low miR-100 expression had poorer OS and EFS than those with high expression. Conclusion miR-100 expression may be used as a prognostic biomarker for patients with CN-AML.

microRNA-100 Acute myeloid leukemia Prognosis

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.19.2017-629

321000 金華市中心醫院（浙江大學金華醫院）血液科

趙明哲，E-mail：zhaomingzhe111@126.com

2017-03-22）

（本文編輯：李媚）