黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母SMD1168中的表達(dá)

陳 楠， 肖成建， 范新蕾， 李漢廣， 余曉斌

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母SMD1168中的表達(dá)

陳 楠， 肖成建， 范新蕾， 李漢廣， 余曉斌*

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

在畢赤酵母SMD1168中利用乙醇氧化酶AOX1強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)黑曲霉葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）。提取黑曲霉Aspergillus niger PCTC的基因組DNA，以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得葡萄糖氧化酶基因，將目的基因插入到具有AOX1強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體pPICZαA上，經(jīng)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母SMD1168中。經(jīng)zeocin抗性平板初篩、搖床復(fù)篩以及SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳的檢測(cè)，獲得了一株產(chǎn)葡萄糖氧化酶活力的菌株，該株菌在30℃、200 r/min的培養(yǎng)條件下，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)1.0%的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵1 d可獲得1.12 U/mL的酶活。對(duì)該菌株進(jìn)行了搖瓶產(chǎn)酶條件優(yōu)化，其最佳發(fā)酵條件為：在pH 5、30℃下經(jīng)體積分?jǐn)?shù)1.5%甲醇誘導(dǎo)7 d，酶活為32 U/mL。

葡萄糖氧化酶；黑曲霉；畢赤酵母；異源表達(dá)；啟動(dòng)子

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）系統(tǒng)命名為β-D-葡萄糖：氧化還原酶（EC1.1.3.4）。葡萄糖氧化酶能專一性地氧化β-D-葡萄糖，生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，因而具有除氧、抗氧化、去除葡萄糖以及生成葡萄糖酸的作用，近幾十年來(lái)被廣泛應(yīng)用于與人體健康密切相關(guān)的食品、醫(yī)藥、生物技術(shù)等行業(yè)[1]。例如，它能有效地改善小麥面筋的組織結(jié)構(gòu)，提高面團(tuán)的持氣性、彈性、韌性和持水性，從而提升了面包的質(zhì)量[2]；在白葡萄酒生產(chǎn)中，加入GOD/CAT系統(tǒng)后，可有效防止酚類和多酚氧化酶對(duì)白葡萄酒產(chǎn)生的嚴(yán)重褐變[3]；葡萄糖氧化酶催化產(chǎn)生的過(guò)氧化氫可在紡織品中充當(dāng)漂白劑的作用[4]；葡萄糖氧化酶也可作為抑制微生物的成分添加到口腔護(hù)理產(chǎn)品中[5]；此外，葡萄糖氧化酶是新型傳感器中的重要的組成部分，可以用來(lái)測(cè)定糖含量[6]。

目前，葡萄糖氧化酶廣泛采用黑曲霉或青霉發(fā)酵進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，但在此過(guò)程中常常伴有過(guò)氧化氫酶、淀粉酶及纖維素酶等大量雜蛋白的產(chǎn)生[7]。近10年來(lái)，巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的操作簡(jiǎn)單、表達(dá)量高、穩(wěn)定性強(qiáng)、能進(jìn)行多種翻譯后加工修飾等特點(diǎn)使其成為目前應(yīng)用最廣泛的外源蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)之一[8]。兩種從青霉Penicillium variabile P16[9]和黑曲霉9029[10]獲得的GOD基因都在巴斯德畢赤酵母中獲得了表達(dá)，前者在發(fā)酵11 d的條件下酶活為0.33 U/mL，后者的酶活最高為1.62 U/mL。作者采用的黑曲霉PCTC與上述文獻(xiàn)報(bào)道的霉菌、葡萄糖氧化酶基因序列的相似度分別為96%和99%。

作者從黑曲霉PCTC中克隆了GOD基因，并用其轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)缺陷型畢赤酵母SMD1168，以期獲得高效表達(dá)GOD蛋白酶缺陷型畢赤酵母生產(chǎn)用菌株。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 黑曲霉菌株P(guān)CTC：由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存，葡萄糖氧化酶基因來(lái)自該菌株；質(zhì)粒pMD18-T：用來(lái)構(gòu)建克隆載體；大腸桿菌JM109：用來(lái)構(gòu)建和克隆目的基因；質(zhì)粒pPICZαA：用來(lái)表達(dá)目的基因；畢赤酵母SMD1168：作為表達(dá)目的基因的宿主。

1.1.2 試劑與儀器 工具酶、PCR相關(guān)試劑、XhoI、NotI限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶：購(gòu)自Takara公司；PmeI：購(gòu)自紐英倫生物技術(shù)有限公司；真菌基因組DNA快速抽提試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNA標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量marker和Amp（氨芐青霉素）等：購(gòu)自上海生工生物有限公司；瓊脂糖、辣根過(guò)氧化物酶、鄰聯(lián)茴香胺等：購(gòu)自Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺：Bio-Rad產(chǎn)品；色譜純甲醇及其他試劑（分析純）：均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；PCR儀和電轉(zhuǎn)化儀：Eppendorf公司；電泳儀：北京六一儀器廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）Aspergillus niger PCTC活化培養(yǎng)基 （PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯 200 g，加水 1 L，煮沸 30 min，用兩層紗布過(guò)濾，補(bǔ)水至1 L，加入20 g葡萄糖，自然pH，121℃下滅菌20 min。配置固體培養(yǎng)基時(shí)加入2 g/dL瓊脂粉。

2）Aspergillus niger PCTC種子培養(yǎng)基：葡萄糖9 g/dL，KH2PO40.09 g/dL，MgSO4·7H2O 0.09 g/dL，（NH4）2PO40.18 g/dL，尿素 0.05 g/dL，玉米粉 0.9 g/dL，吐溫-60（TW-60）1.5 g/dL；自然 pH，121 ℃下滅菌20 min。

3）LB培養(yǎng)基：蛋白胨 1 g/dL，酵母膏 0.5 g/dL，NaCl 1 g/dL；pH 7.0，121 ℃下滅菌 20 min， 配置固體平板時(shí)加入2 g/dL瓊脂粉。抗性培養(yǎng)基中Amp的最終質(zhì)量濃度是100 μg/mL。

4）LLB培養(yǎng)基：蛋白胨1 g/dL，酵母膏0.5 g/dL，NaCl 1 g/dL；pH 7.0，121 ℃下滅菌 20 min。 配置固體平板時(shí)加入2 g/dL瓊脂粉。抗性培養(yǎng)基中zeocin的終質(zhì)量濃度為25 μg/mL。

5）YPD培養(yǎng)基：在約800 mL的去離子水中加入酵母膏10 g，蛋白胨20 g，定容至900 mL，高壓滅菌后，加入100 mL 10×D。配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入2 g/dL瓊脂。抗性培養(yǎng)基中zeocin的終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，4 ℃避光保存。

6）YPG培養(yǎng)基：用10×GY代替YPD培養(yǎng)基中的 10×D。

7）YPDS培養(yǎng)基：在約800 mL的去離子水中加入酵母膏10 g，蛋白胨20 g，D-山梨醇 182.2 g，定容至900 mL，高壓滅菌后，加入100 mL 10×D。配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入2 g/dL瓊脂。抗性培養(yǎng)基中zeocin的終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，4℃避光保存。

8）BMMY 培養(yǎng)基：酵母膏 10 g，蛋白胨 20 g，加入800 mL水中，121℃下滅菌20 min，冷卻至室溫加入滅菌的1 mol/L磷酸鉀緩沖液100 mL，10×YNB 100 mL，500×B（過(guò)濾滅菌） 2 mL，甲醇 5 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取和目的基因的克隆

1）黑曲霉PCTC菌體預(yù)處理：采用POD培養(yǎng)基平板活化黑曲霉PCTC，于28℃下培養(yǎng)24 h，刮取孢子配置成懸液，接種到含有50 mL種子液的250 mL搖瓶中。取培養(yǎng)好的種子液以相同的方法接種到含有 1.5%吐溫-60（TW-60）的搖瓶中，于 200 r/min、30℃搖床中培養(yǎng)24 h。將數(shù)顆滅菌的玻璃珠加入到搖瓶中，置于200 r/min搖床中振蕩3～4 h，取15～20 mL的菌液進(jìn)行抽濾。

2）基因組DNA的提取：取上述抽濾好的菌體采用試劑盒法提取基因組DNA，參照上海生工真菌基因組DNA快速抽提試劑盒說(shuō)明書提取黑曲霉PCTC的基因組DNA。

3）目的基因的獲得：設(shè)計(jì)如下引物：

以黑曲霉基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，在T4連接酶的作用下連接到pMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)化E.coli JM109，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-GOD1，經(jīng)菌落PCR鑒定獲得陽(yáng)性克隆子。

在克隆A.niger PCTC葡萄糖氧化酶基因時(shí)，上游引物5’端引入了位于表達(dá)載體pPICZαA的αfactor信號(hào)肽XhoI酶切位點(diǎn)序列 （下劃線部分）和Kex2信號(hào)肽酶切位點(diǎn)序列（粗體部分），同時(shí)去除了葡萄糖氧化酶完整閱讀框中的信號(hào)肽序列，下游引物引入了NotI酶切位點(diǎn)序列（下劃線部分），其序列如下：

以重組質(zhì)粒pMD18-T-GOD1為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，在T4連接酶的作用下連接到pMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)化E.coli JM109，經(jīng)菌落PCR鑒定獲得陽(yáng)性克隆子，同時(shí)提取pMD18-T-GOD質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用XhoI和NotI分別將pPICZαA和pMD18-T-GOD質(zhì)粒酶切。用膠回收試劑盒將pMD18-T-GOD質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物和pPICZαA質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物回收純化。在T4連接酶的作用下構(gòu)建 pPICZαA-GOD， 轉(zhuǎn)化E．coli JM109，經(jīng)zeocin抗性平板篩選和菌落PCR鑒定，同時(shí)送至上海生工測(cè)序驗(yàn)證，保存測(cè)序正確的菌株。

1.2.3 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化及篩選 采用電轉(zhuǎn)化法。重組質(zhì)粒pPICZαA-GOD經(jīng)PmeI酶切后線性化。用線性化pPICZαA-GOD質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168感受態(tài)細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂于含100 μg/mL zeocin的YPDS平板上，30℃培養(yǎng)3 d。隨機(jī)挑選陽(yáng)性菌落轉(zhuǎn)接液體YPD （含100 μg/mL，以下同），培養(yǎng)3 d后離心收集細(xì)胞，用試劑盒提取基因組DNA并以其為模板、以5’AOX1和GOD-R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以篩選、鑒定轉(zhuǎn)化子SMD1168-GOD。AOX1引物如下：

將 YPDS 平板（zeocin 100 μg/mL）上轉(zhuǎn)化的單菌落用無(wú)菌牙簽依次點(diǎn)種到含zeoein質(zhì)量濃度分別為 500、1000、2 000 μg/mL 的 YPDS 平板上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d，觀察酵母轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)情況，逐級(jí)篩選含有多拷貝目的基因的重組酵母菌株。

1.2.4 搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化 為了提高畢赤酵母的產(chǎn)酶活性，作者對(duì)pH值、誘導(dǎo)溫度、甲醇體積分?jǐn)?shù)和誘導(dǎo)時(shí)間等4個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化。將篩選獲得的高拷貝酵母工程菌作為生產(chǎn)菌株，將其接種于YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，然后接入15 mL YPG培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，室溫沉淀1～2 h，倒掉上層培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入50 mL（250 mL三角瓶）液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY，置于30℃，200 r/min搖床培養(yǎng)，每24小時(shí)補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)1%的甲醇，誘導(dǎo)產(chǎn)酶。pH 設(shè)置為 4、5、6、7、8 五個(gè)梯度；誘導(dǎo)溫度分別設(shè)為 15、20、25、30、35 ℃；甲醇體積分?jǐn)?shù)選擇0.5%、1%、1.5%、2%、3%五個(gè)濃度，72 h后測(cè)定培養(yǎng)物的細(xì)胞密度以及上清液的葡萄糖氧化酶。每天取樣測(cè)定酶活性、OD600來(lái)確定最佳發(fā)酵時(shí)間。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)來(lái)確定誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間。

1.2.5 重組葡萄糖氧化酶的分離純化 采用飽和硫酸銨沉淀法。將重組酵母SMD1168-GOD的培養(yǎng)液于5 000 r/min離心5～10 min，收集上清液即為粗酶液。向粗酶液中加入飽和硫酸銨，于4℃靜置過(guò)夜，10 000 r/min離心15 min，收集上清液，即為純化后的酶液。

1.2.6 SDS-PAGE檢測(cè) 利用粗酶液和純化后的酶液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色及脫色，利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.7 酶活性的測(cè)定 酶活性測(cè)定方法采用Sigma公司和周建芹[11]的方法并加以改進(jìn)：配置21 μmol/mL的雙氧水標(biāo)準(zhǔn)液，反應(yīng)體系中含有2.5 mL的0.21 mmol/L的鄰聯(lián)茴香胺溶液，0.4 mL的10 g/dL葡萄糖溶液，0.1 mL的60 U/mL的辣根過(guò)氧化物酶，再加入不同體積的21 μmol/mL雙氧水，在37℃下預(yù)熱5 min，加醋酸-醋酸鈉緩沖溶液補(bǔ)到10 mL，在OD525下測(cè)定吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)，以濃度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的測(cè)定用1 mL稀釋好的樣品代替雙氧水，反應(yīng)1 min測(cè)定OD值然后計(jì)算酶活性大小，酶活性單位定義為：37℃下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol的雙氧水所需要的酶量做為一個(gè)酶活單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉GOD基因的分析

如圖1所示，用黑曲霉PCTC基因組DNA及引物GOD-F和GOD-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增可獲得一條約2.0 kb的DNA片段。通過(guò)測(cè)序和比對(duì)分析顯示，該片段包含GOD基因，其全長(zhǎng)為1 818 bp，編碼605個(gè)氨基酸，將其序列與Genbank中其他葡萄糖氧化酶基因的序列進(jìn)行對(duì)比，其相似度在92%～98%之間。

圖1 黑曲霉基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification from PCTC

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將用引物GOD-F1和GOD-R1經(jīng)PCR擴(kuò)增并純化回收的黑曲霉GOD基因連接到pMD18-T上。將質(zhì)粒pMD18-T-GOD和pPICZαA進(jìn)行雙酶切以構(gòu)建重組質(zhì)粒，見圖2。用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E.coli JM109，并在含zeocin的LB平板上篩選陽(yáng)性菌落。隨機(jī)挑選21個(gè)菌落，利用AOX1引物對(duì)挑取的菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果有20個(gè)菌落出現(xiàn)了陽(yáng)性結(jié)果，顯示有5.4 kb大小的條帶，為目的基因和pPICZαA片段大小的總和（1.8 kb+3.6 kb）。對(duì)PCR鑒定結(jié)果正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行NotI和XhoI雙酶切鑒定，圖3為酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果，顯示有1.8 kb和3.6 kb大小的條帶，分別為目的基因和表達(dá)載體片段的長(zhǎng)度，證明GOD基因已經(jīng)插入到表達(dá)載體pPICZαA中。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示，目的基因的完整閱讀框序列已正確插入到pPICZαA載體αfactor信號(hào)肽下游，重組表達(dá)載體pPICZαA-GOD構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pPICZαA-GOD構(gòu)建示意圖Fig.2 Diagram for construction of the recombinant plasmid pPICZαA-GOD

2.3 畢赤酵母宿主菌轉(zhuǎn)化與篩選

將已經(jīng)線性化的重組表達(dá)載體pPICZαA-GOD電擊轉(zhuǎn)化，2～3 d后長(zhǎng)出約50個(gè)酵母轉(zhuǎn)化子。用牙簽挑取轉(zhuǎn)化單菌落依次點(diǎn)種在含有zeocin質(zhì)量濃度分別為 500、1 000、2 000 μg/mL 的 YPDS 平板上。3 d后，酵母轉(zhuǎn)化子在YPDS抗性梯度平板上的生長(zhǎng)情況見圖4。結(jié)果表明，隨著zeocin質(zhì)量濃度的逐級(jí)增加，長(zhǎng)出的酵母轉(zhuǎn)化子逐漸減少，a和b為長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株，而c則為點(diǎn)種后未生長(zhǎng)的菌，仍為點(diǎn)種前的形態(tài)。挑取在YPDS平板（zeocin 2 000 μg/mL）上生長(zhǎng)較好的重組酵母單菌落，進(jìn)行下一步的篩選鑒定。對(duì)篩選得到的若干菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，通過(guò)體積分?jǐn)?shù)1.0%的甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵1 d獲得了一株產(chǎn)酶最高為1.12 U/mL的菌株。

圖3重組質(zhì)粒pPICZαA-GOD的雙酶切鑒定Fig.3 Identificationg of pPICZαA-GOD with double restriction enzymes digestion with double restriction enzymes digestion

圖4 酵母轉(zhuǎn)化子的抗性篩選Fig.4 Screening of P.pastoris transformants by zeocin resistance

挑取上述重組酵母的基因組，用作PCR鑒定的模板，利用上游引物5’-AOX1和下游引物GODR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖5。以重組酵母基因組DNA為模板擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物有2.1 kb大小的條帶，為葡萄糖氧化酶基因和部分AOX1啟動(dòng)子序列大小的總和 （1.8 kb+0.3 kb），證明目的基因已經(jīng)定向整合到重組酵母菌株的基因組上。利用篩選出來(lái)的SMD1168-GOD菌株的培養(yǎng)物上清液做蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳，可見一條濃染的、大小約為90 000的蛋白質(zhì)條帶，見圖6。黑曲霉的GOD亞基相對(duì)分子質(zhì)量為65 000～95 000，因此該結(jié)果提示SMD1168-GOD可以表達(dá)黑曲霉GOD蛋白。圖7則為通過(guò)飽和硫酸銨沉淀法，純化SMD1168-GOD菌株培養(yǎng)物上清液獲得的GOD的SDS-PAGE電泳圖譜。

圖5 重組質(zhì)粒pPICZαA-GOD的PCR鑒定Fig.5 PCR identification of pPICZαA-GOD

圖6SMD1168-GOD菌株培養(yǎng)液上清液蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of proteins in the culture supernant of SMD1168-GOD

圖7GOD純化后的SDS-PAGE圖譜Fig.7 SDS-PAGE analysis of the purified GOD

2.4 重組酵母發(fā)酵條件的優(yōu)化

對(duì)pH值、誘導(dǎo)溫度、甲醇濃度和誘導(dǎo)時(shí)間等4個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)pH為5時(shí)，重組酵母的葡萄糖氧化酶表達(dá)活力最高，見圖8a。當(dāng)pH繼續(xù)升高時(shí)，酶活性開始下降，這可能是由于酶在弱堿性的環(huán)境下變的不穩(wěn)定造成的；不同溫度下誘導(dǎo)產(chǎn)酶發(fā)現(xiàn)，30℃下產(chǎn)酶較高，見圖8b；甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)酶也有很大影響，由圖8c可以看出，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，酶活性和菌濃度顯著增加，但是當(dāng)其體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1.5%的時(shí)候，酶活性不再提高，且菌體的密度也開始下降，這說(shuō)明甲醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)會(huì)抑制重組酵母產(chǎn)酶及生長(zhǎng)；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，菌體密度持續(xù)增加，酶活性也不斷增加，二者存在著正相關(guān)，在第7天時(shí)葡萄糖氧化酶的活性達(dá)到最高，為17.25 U/mL，見圖8d。通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化，獲得了最佳發(fā)酵條件為pH 5，30℃下經(jīng)1.5%甲醇誘導(dǎo)8 d，獲得的酶活最高為32 U/mL，是優(yōu)化前的28倍。與Crognale等[9]利用青霉P16 GOD基因表達(dá)的酶活相比較，不僅酶活提高了96倍，且在發(fā)酵時(shí)間上減少了4 d。在表達(dá)宿主的選擇上，作者采用了蛋白質(zhì)缺陷型畢赤酵母SMD1168，可以將GOD分泌到細(xì)胞外，與劉虎軍等[12]在畢赤酵母GS115中表達(dá)GOD相比較，不僅酶活提高了15%，且便于下游的提純生產(chǎn)。與GUO等[13]比較，在培養(yǎng)基中補(bǔ)加甲醇的體積分?jǐn)?shù)降低了0.5%，減少了甲醇對(duì)細(xì)胞的毒性。

圖8 重組酵母發(fā)酵條件的優(yōu)化Fig.8 Optimization of fermentation conditions

3 結(jié)語(yǔ)

畢赤酵母的選擇顯著影響外源基因的表達(dá)，本研究所選擇的畢赤酵母宿主SMD1168是蛋白缺陷型菌株，其Pep4基因突變，缺失蛋白水解酶活性，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物降解少[14]，可能會(huì)對(duì)葡萄糖氧化酶的表達(dá)量產(chǎn)生影響。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)通常以分泌表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)兩種方式來(lái)產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)。作者剔除了GOD基因自身長(zhǎng)為66 bp的信號(hào)肽序列，將其成熟肽編碼序列融合在α-mating factor信號(hào)肽序列下游，使得葡萄糖氧化酶能夠分泌表達(dá)，便于下游的提取和純化。另外，在α-mating factor信號(hào)肽序列上存在Ste13內(nèi)肽酶酶切位點(diǎn)（Glu-Ala-Glu-Ala）和Kex2內(nèi)肽酶酶切位點(diǎn)（Glu-Lys-Arg）[15]，作者在設(shè)計(jì)擴(kuò)增GOD基因的上游引物時(shí)，剔除了Ste13內(nèi)肽酶酶切位點(diǎn)，而引入了Kex2內(nèi)肽酶酶切位點(diǎn)，從而避免了表達(dá)蛋白質(zhì)的N-端帶有的多余氨基酸殘基。

本研究獲得的重組菌能夠在以甲醇作為惟一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并在其誘導(dǎo)下高效表達(dá)葡萄糖氧化酶基因，在pH 5、30℃下，以1.5%的甲醇誘導(dǎo)7 d，其酶活性達(dá)32 U/mL。周亞鳳[16]等利用pPIC9質(zhì)粒將來(lái)源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母 GS115中表達(dá)，酶活 30～40 U/mL；Masaki Yamaguchi[10]等利用pGAP啟動(dòng)子在畢赤酵母X33中表達(dá)黑曲霉9029 GOD基因，培養(yǎng)重組酵母14 d后，培養(yǎng)物上清液的平均酶活僅有1.23 U/mL。一般認(rèn)為不同的表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)宿主對(duì)外源基因的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生很大的影響；選擇不同的啟動(dòng)子和信號(hào)肽也會(huì)影響外源蛋白質(zhì)的表達(dá)；此外，重組酵母不同的拷貝數(shù)同樣會(huì)對(duì)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)量產(chǎn)生巨大作用。因此，通過(guò)利用不同的表達(dá)載體和宿主菌、選用不同的啟動(dòng)子和信號(hào)肽、篩選高拷貝的菌株會(huì)進(jìn)一步提高重組菌的GOD表達(dá)水平。

[1]BANKS J G，BOARD R G，SPARKS N H.Natural antimicrobial systems and their potential in food preservation of the future[J].Biotechnol Appl Biochem，1986，8（2-3）：103-147.

[2]BONET A.Glucose oxidase effect on dough rheology and bread quality：a study from macroscopic to molecular level[J].Food Chemistry，2006,99（2）：408-415.

[3]GOMEZ E，MARTINEZA，LAENCINA.Prevention ofoxidative browning during wine storage[J].Food Research International，1995，28：213-217.

[4]TZANOV T.Hydrogen peroxide generation with immobilized glucose oxidase for textile bleaching[J].Biotechnol，2002，93（1）：87-94.

[5]AFSETH J，ROLLA G.Clinical experiments with a toothpaste containing amyloglucosidase and glucose oxidase[J].Caries Res，1983，17（5）：472-475.

[6]CHANG G.Glucose concentration determination based on silica sol-gel encapsulated glucose oxidase optical biosensor arrays[J].Talanta，2010，83（1）：61-65.

[7]KAPAT A，JUNG J K，PARK Y H.Improvement of extracellular recombinant glucose oxidase production in fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae：Effect of different feeding strategies[J].Biotechnology Letters，1998，20（3）：319-323.

[8]CEREGHINO J L，CREGG J M.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMS Microbiol Rev，2000，24（1）：45-66.

[9]CROGNALE S.Expression of Penicillium variabile P16 glucose oxidase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme[J].Enzyme and Microbial Technology，2006，39：1230-1235.

[10]MASAKI Y，YUSUKE T，ATSUNORI N，et al.Secretory and continuous expression of Aspergillus niger glucose oxidase gene in Pichia pastoris[J].Protein Expression and Purification，2007，55（2）：273-278.

[11]ZHOU Jianqin，CHEN Shao，WANG Jianwen.A simple and convenient method to determine the activity of glucose oxidase[J].Experimental Technology and Management，2008，25：58-60.（in Chinese）

[12]LIU Hujun，LUO Wei，F(xiàn)AN Xinlei，et al.Cloning and heterologous expression of glucose oxidase gene from Aspergillus niger PCTC in Pichia pastoris[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2013，32（6）：615-621.（in Chinese）

[13]Y G，F(xiàn) L，H Z，et al.Cloning and heterologous expression of glucose oxidase gene from Aspergillus niger Z-25 in Pichia pastoris[J].Appl Biochem Biotechnol，2010，162（2）：498-509.

[14]FENG Jiankai，SUN Wanbang，CHEN Fuchao，et al.Plasmid construction and expression in Pichia pastoris SMD1168 of recombinant human interleukin-10 and purification[J].Biotechnology Bulletin，2010，212（3）：168-172.（in Chinese）

[15]BRAKE A J.α-factor-directed synthesis and secretion of mature foreign proteins in Saccharomyces cerevisiae[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1984（15）：4642-4646.

[16]ZHOU Yafeng，ZHANG Xianen，LIU Hong，et al.Cloning and expression of Aspergillus niger glucose oxidase gene in methylotrophic yeast[J].Chinese Journal of Biotechnology，2001，17（4）：400-405.（in Chinese）

Expression of Aspergillus niger Glucose Oxidase Gene in Pichia pastoris SMD1168

CHEN Nan， XIAO Chengjian， FAN Xinlei， LI Hanguang， YU Xiaobin*
（School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Aspergillus niger glucose oxidase （GOD） was expressed in Pichia pastoris SMD1168 with the alcohol oxidase gene promoter （AOX1）.A gene of glucose oxidase from Aspergillus niger PCTC was cloned.The gene was fused to the pPICZαA plasmid which had the alcohol oxidase gene promoter （AOX1） and expressed in Pichia pastoris SMD1168.After screening by zeocin gradient resistance plate ，shake culture，and the SDS-PAGE analysis of proteins in the culture，one strain was obtained，which gave the higest enzyme activity （1.12 U/mL） after one day induction by 1%methanol.Through the optimization of the shake flask experiments，the highest enzyme activity of 32 U/mL was achieved in the flask by induction for 7 d under optimal conditions （30 ℃，200 r/min，pH 5 and 1.5%methanol）.

glucose oxidase，Aspergillus niger，Pichia pastoris，heterologous expression，promoter

TQ 920.1

A

1673—1689（2017）09—0975—07

2015-03-17

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（JUSRP111A24）；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目（111206）。

*通信作者：余曉斌（1965—），男，安徽蕪湖人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵法生產(chǎn)功能食品因子方面的研究。

E-mail：xbyu@jiangnan.edu.cn

陳楠，肖成建，范新蕾，等.黑曲霉葡萄糖氧化酶基因在畢赤酵母SMD1168中的表達(dá)[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（09）：975-981.