鐵皮石斛莖部和葉部多糖的性質和活性

張又元 ， 陳乃偉 ， 丁重陽 *， 顧正華， 張 梁 ， 石貴陽

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫214122；3.紹興儒林生物科技有限公司，浙江 紹興 312000）

鐵皮石斛莖部和葉部多糖的性質和活性

張又元1，2， 陳乃偉3， 丁重陽*1，2， 顧正華2， 張 梁1，2， 石貴陽2

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫214122；3.紹興儒林生物科技有限公司，浙江 紹興 312000）

鐵皮石斛是一種含有多種活性物質的名貴中藥，目前主要利用其莖部進行活性和結構等方面的研究。作者通過研究和比較鐵皮石斛莖部和葉部中的各種物質的質量分數和分布，發現莖部與葉部中物質組成相同，但莖部中多糖和石斛堿質量分數分別是葉部的2.71和3.02倍，而脂溶性成分和粗蛋白在葉部的質量分數要明顯高于莖部。將提取后的莖部和葉部多糖進行分析，發現兩種多糖的單糖組成具有較大差異，莖部多糖主要由甘露糖和葡萄糖組成，摩爾比為3.07∶1，葉部多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，摩爾比為 8.81∶1∶0.57∶0.37。 此外，莖部和葉部多糖特性粘度分別為56.26、8.05 dL/g，與之對應的相對分子質量分別為1 207 000和318 000，為高相對分子質量高粘度的生物大分子。在抗氧化活性實驗中，清除DPPH自由基的結果顯示，葉部多糖明顯優于莖部多糖，表明其具有較高的抗氧化應用價值。在對提取條件中的溫度、提取時間和料液比進行考察后，最終確定了莖部和葉部多糖提取的最優條件。

鐵皮石斛；多糖；單糖組成；DPPH自由基；多糖提取

鐵皮石斛（Dendrobium officinale），俗稱石斛蘭，是一種集觀賞和藥用為一體的名貴中草藥，自古就有“藥中黃金”之稱，在我國主要分布在西南及江南各省[1]。我國藥典收藏的石斛有5種，但其中以具有較高的藥用價值的鐵皮石斛最為珍稀[2]。通過現代分析手段檢測后發現，鐵皮石斛中主要活性成分為多糖、生物堿、氨基酸、菲類化合物等，其中多糖作為主要的活性物質備受研究者關注[3]。在本草考證中石斛的藥用部位是莖部，但在《中國藥典》（95年版）、《中藥志》、《中藥鑒定學》等現代文獻中均將石斛列為以全草為藥用部位的全草類中藥，市場上的鐵皮石斛制品亦多為以楓斗、膠囊等石斛莖部的粗加工原料為產品，而以石斛葉部為原料的產品較少[4-6]。國內外對鐵皮石斛研究中也以其莖部為主要對象，鮮有以石斛葉部為研究對象。為達到合理利用鐵皮石斛資源的目的，作者通過比較鐵皮石斛莖部和葉部中的活性物質種類和質量分數，并分析其結構和活性方面的差異，為石斛資源的綜合開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）由紹興儒林生物科技有限公司提供。鮮植株洗凈泥沙等雜質，莖部和葉部分離后切碎，冷凍干燥至恒質量。中藥粉碎機粉碎，過50目篩，保存在干燥器中備用。

DPPH自由基、石斛堿標樣：購自北京萬佳首化生物科技有限公司；葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖標樣：購自中國藥品生物制品鑒定所；甘露糖、半乳糖標樣：購自上海江萊生物科技有限公司；巖藻糖、木糖、牛血清白蛋白：購自Sigma公司；濃硫酸、苯酚等其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 總糖和多糖質量分數測定 精確稱取樣品干粉1 g，放入三角瓶中，加入30 mL水，90℃超聲水浴1.5 h，抽濾，濾渣重復上述步驟兩次，合并3次所得濾液，濾液定容至100 mL，即得總糖供試液；取一定體積總糖供試液，適當濃縮后，加入4倍體積95%乙醇醇沉，用無水乙醇洗滌沉淀，揮干乙醇后用蒸餾水溶解，定容到100 mL，即得多糖供試液。取一定體積供試液，適當稀釋后用苯酚硫酸法測定總糖和多糖質量分數。

1.2.2 粗蛋白質與粗脂肪質量分數測定 采用凱氏定氮法測定粗蛋白質質量分數：精確取樣品干粉0.5 g于消化管，加入6.0 g硫酸銅硫酸鉀混合物和12 mL濃硫酸，400℃消化2 h，用凱氏定氮儀定氮，計算粗蛋白質質量分數（換算系數按6.25計）。

采用索氏提取法測定粗脂肪質量分數：精確取樣品干粉2.0 g，用濾紙筒包裹好后精確稱質量，放入抽提筒內于索氏抽提器中用無水乙醚抽提6 h。抽提完成后，取下濾紙筒在烘箱內干燥至恒質量，精確稱質量。用失重法計算粗脂肪質量分數。

1.2.3 總灰分和石斛堿質量分數測定 總灰分測定按照國標GB 50094-2010 《食品中灰分的測定》方法測定[7]。石斛堿參考歐德明[8]等報道的方法測定：精確稱取0.5 g樣品粉末，加50 mL氯仿回流提取，取適量提取液減壓蒸干，加甲醇溶解定容，用0.45μm微孔濾膜過濾后用HPLC法檢測石斛堿含量。

1.2.4 鐵皮石斛粗多糖制備及特性粘度測定 鐵皮石斛多糖制備參照李強等人[9]的方法進行。即稱取50目干粉末樣品，依次用丙酮和甲醇索氏抽提脫脂直至提取液無色。棄去提取液，50℃烘干24 h得脫脂樣品。脫脂后的莖部和葉部干粉在90℃熱水提取2 h，料液比1∶100，分兩次提取。提取液醇沉后用水溶解，冷凍干燥即得粗多糖。

特性粘度通過系列稀釋法測定[10]，即用蒸餾水配置1 mg/mL多糖樣品溶液，稀釋成不同質量濃度，用烏式粘度計在 25 ℃下測定，特性粘度[η]為 ln（ηr/c），對c作圖在Y軸上的截距。其中ηr為多糖溶液的相對粘度，c為樣品質量濃度。

1.2.5 鐵皮石斛多糖的單糖組成和相對分子質量分布分析 單糖組成用氣相色譜法測定。多糖樣品用硫酸法水解，水解樣品和單糖標樣衍生生化后用于氣象色譜分析，具體方法參照文獻[11]進行；多糖相對分子質量分布用高效凝膠過濾色譜（HPGFC）法測定。多糖樣品用流動相溶解，用0.45 μm微孔濾膜過濾后用高效凝膠過濾色譜（HPGFC）分析。具體方法參照文獻[11]進行。

1.2.6 鐵皮石斛多糖的自由基清除能力測定 羥基自由基清除能力測定參考文獻[12]進行。即在1 mL 磷酸鈉緩沖液 （15 mmol/L，pH 7.4）、1 mL 番紅花 T（360 mg/L）、0.5 mL EDTA-Fe（2 mmol/L）和 1 mL 3%H2O2組成的反應體系中加入不同質量濃度的多糖樣品溶液，37℃水浴反應30 min，自由基含量由分光光度計在520 nm測定。對照組樣品用蒸餾水代替，H2O2用緩沖液代替，VC為陽性對照。

其中，Sc為清除率，As為樣品組吸光值，Ac為對照組吸光值。

DPPH自由基清除能力測定參考賓宇波[13]的方法進行。取1 mg DPPH于20 mL甲醇超聲溶解。整個過程盡量避光，現配現用。取樣品和VC溶液2 mL和DPPH自由基溶液2 mL混合，搖勻后在室溫下避光反應30 min，于515 nm處測定吸光值，計算多糖對DPPH自由基清除率。其中，A0為對照組吸光度，Ai為樣品組吸光值，Aj為對應的本底吸收。

1.2.7 鐵皮石斛多糖提取條件的優化 在優化鐵皮石斛莖部和葉部多糖提取條件時，采用單因素實驗方法分析不同溫度、提取時間和料液比對多糖提取效率的影響。在考察不同條件的影響時，僅改變考察條件，保持其他條件與基本提取條件一致。鐵皮石斛莖部多糖提取的基本條件為：90℃下、料液比為1∶90提取90 min，選取考察的溫度為50、65、80、90、95 ℃， 考察的提取時間為 30、60、90、120、180、240 min， 考察的料液比為 1∶30，1∶50，1∶70，1∶90，1∶120。鐵皮石斛葉部多糖提取的基本條件為：90℃下、料液比為1∶50提取90 min，提取優化中考察的溫度為 30、50、70、90、95 ℃， 考察的提取時間為 10、30、60、90、120、180 min，考察的料液比為 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶60。

2 結果與討論

2.1 鐵皮石斛莖部和葉部位化學成分分析

對于鐵皮石斛成分的測定，不同采收時間、不同產地及不同的培養方式都對其成分有著很大影響[14]。在分別對鐵皮石斛莖部和葉部中的成分進行分析后發現，鐵皮石斛的主要活性成分多糖和石斛堿在莖部中的質量分數分別為葉部含量的2.71倍和3.02倍，見表1。此結果與周桂芬、尚喜雨等[15-17]對鐵皮石斛成分分析的結果相似。在其他成分含量中，粗蛋白和粗脂肪在葉部明顯高于莖部，水分質量分數相近。雖然葉部活性物質如多糖和石斛堿質量分數低于莖部，但石斛全草中石斛葉部資源所占比例很可觀，因此采用合理的分離純化手段可以達到提高石斛資源利用率的目的。

2.2 鐵皮石斛莖部和葉部多糖理化性質分析

為比較鐵皮石斛莖部和葉部多糖的差異，分別將莖部和葉部進行多糖提取及純化，得到純度分別為 67.58%和 42.11%的多糖 DOSP和 DOLP，將DOSP和DOLP用于氣相色譜分析，結果見圖1-2。在多糖中的單糖組成方面，DOSP主要由甘露糖和葡萄糖組成，摩爾比為3.07∶1，DOLP主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，摩爾比為8.81∶1∶0.57∶0.37。雖然莖部和葉部多糖單糖組成有較大差異，但主要單糖皆為甘露糖和葡萄糖，莖部多糖中甘露糖和葡萄糖質量分數占多糖的98.59%，可以認為其主體是甘露葡聚糖。其他研究者分析鐵皮石斛多糖的單糖組成時發現，石斛多糖包含了甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和木糖等幾乎所有常見單糖，單糖組成也隨著分離純化片段及原材料的不同有很大區別[17]。

考馬斯亮藍比色法測定DOSP和DOLP水溶性蛋白質質量分數為0.32%和0.43%，見表2。全波長檢測顯示260 nm和280 nm檢測均無明顯吸收峰，表明多糖中無明顯核酸和蛋白質等大分子。粘度是一種重要的理化指標，也是食品藥品加工過程及食用過程中的重要指標，特性粘度反映了生物大分子的相對分子質量，對大分子溶解度、溶液特性有很大影響。表2結果顯示，鐵皮石斛莖部多糖DOSP是高相對分子質量、高粘度的生物大分子，相對葉部多糖DOLP有著更高的相對分子質量和粘度。高相對分子質量和高粘度往往導致低溶解度及理化不穩定性，不利于加工過程控制及臨床應用。和莖部多糖DOSP相比，葉部多糖DOLP具有較低的粘度，與實驗過程中莖部多糖和葉部多糖表現出的溶液特征吻合。

表1 鐵皮石斛莖部和葉部化學成分比較Table 1 Chemical composition of stem and leaf of Dendrobium officinale

圖1 鐵皮石斛莖部多糖DOSP HPGLC色譜圖Fig.1 HPGLC chromatogram of DOSP

圖2 鐵皮石斛葉部多糖DOLP的HPGLC色譜圖Fig.2HPGLC chromatogram of DOLP

表2 鐵皮石斛多糖部分理化性質Table 2 Physical and chemical properties of DOSP and DOLP

2.3 鐵皮石斛莖部和葉部多糖相對分子質量分布

對鐵皮石斛莖部和葉部多糖進行相對分子質量分析后發現，鐵皮石斛多糖相對分子質量較高，其中莖部多糖DOSP達到百萬級，重均相對分子質量Mw1 207 000，為高相對分子質量物質；葉部多糖DOLP包含兩種組分，DOLP1和DOLP2重均相對分子質量Mw為分別為318 000和1 986 000，相對分子質量均低于莖部多糖DOSP。在比較鐵皮石斛莖部和葉部多糖的均一性時發現，僅DOLP2具有較好的均一性，其Mw/Mn（數均相對分子質量）為1.27，而DOSP和DOLP1的相對分子質量分布呈現對稱分布，Mw/Mn分別為3.12和6.62，均一性較差，見表3。由于多糖分子的合成過程是不斷結合寡糖或多糖等結構單元來延長分子鏈，不同結構單元的多糖分子以及非多糖類物質共存導致了多糖的復雜性和非均一性，因此DOLP2具有較好的均一性，可能是由于其相對分子質量較小且結構簡單。相對分子質量是多糖重要的理化指標，與多糖分子的活性息息相關，保持穩定的相對分子質量是生物大分子發揮生物活性的結構保證，但過高的相對分子質量將會影響到多糖的粘度、溶解度和動力學等溶液性質，同時復雜的多糖結構造成多糖理化性質不穩定性不利于多糖的開發。

表3 莖部和葉部多糖相對分子質量分布Table 3 Molecular weight distribution of DOSP and DOLP

2.4 鐵皮石斛多糖自由基清除能力比較

作為鐵皮石斛的主要活性成分，鐵皮石斛多糖具有多種生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、降血糖和免疫調節等。自由基通過強氧化與蛋白質、脂肪等生物大分子發生修飾性反應，進而引起急性損傷、慢性疾病及衰老現象，對機體產生明顯的損傷作用，因此把自由基看作是致病“元兇”和促進衰老的“禍根”[20]。為比較鐵皮石斛多糖的抗氧化活性，作者以VC為陽性對照，利用提取得到的多糖DOSP和DOLP進行了清除羥基自由基和DPPH自由基的能力比較，見圖3。羥基自由基是對生物體危害較大的一種自由基，可以與幾乎所有生物大分子反應而導致機體受損，長時間接觸會引起機體衰老或者癌變[13]。作為鐵皮石斛主要的活性物質，鐵皮石斛多糖和機體受體爭奪自由基，從而起到清除自由基保護機體的作用[13]。由圖3a可以看出，鐵皮石斛多糖DOSP、DOLP及陽性對照VC都具有自由基清除能力，但DOSP和DOLP對自由基的清除率明顯低于陽性對照，隨著多糖質量濃度的增加，羥基自由基清除率也隨之升高。在增加多糖質量濃度的過程中，DOSP和DOLP對羥基自由基的清除效率并沒有明顯差異，表明對于清除羥基自由基而言，鐵皮石斛莖部和葉部多糖具有相同的藥用價值。但在清除DPPH自由基過程中，DOSP和DOLP具有明顯差異，DOSP對DPPH自由基的清除率隨多糖質量濃度增加一直保持較低水平，而DOLP隨質量濃度增加對DPPH自由基的清除率明顯提高。此結果表明，莖部多糖和葉部多糖在清除羥自由基方面具有相似的功能，但在DPPH自由基的清除過程具有較大的差異性。雖然目前鐵皮石斛莖部為主要研究主體，但本研究結果表明，雖然葉部多糖質量分數低于莖部多糖，但在某些生物活性方面較莖部多糖仍具有一定優勢。

圖3 不同質量濃度的鐵皮石斛多糖自由基清除能力比較Fig.3 Comparison of free radicals scavenging activity under different DOSP and DOLP concentration

2.5 鐵皮石斛莖部和葉部多糖提取條件初步優化

為提高鐵皮石斛莖部多糖的提取得率，作者對多糖提取條件中的溫度、提取時間和料液比進行了優化，見圖4。不同提取溫度下莖部多糖的得率結果顯示（圖4a），隨著提取溫度由50℃提高到95℃，多糖的得率由11.7%提高到25.41%，但在溫度由90℃提高至95℃時得率變化較小，因此較適于莖部多糖的提取溫度為90℃。在考察提取時間對多糖得率影響時發現，提取時間由30 min提高到2 h時，多糖得率明顯提高，但超過2 h后多糖得率基本保持不變（圖4b），因此選取2 h為鐵皮石斛莖部多糖的提取時間。鐵皮石斛莖部多糖具有高相對分子質量、高粘度、較難溶解的性質，較低的料液比有利于多糖的溶解。圖4c結果顯示，隨著料液比由1∶30提高至1∶90，莖部多糖得率也隨之提高，而料液比由1∶90提高至1∶120對多糖得率并無較大影響，因此選擇1∶90作為鐵皮石斛莖部多糖的料液比。

圖4 提取條件對莖部多糖得率的影響Fig.4 Influence of extracting conditions of DOSP on the yield of polysacchride

鐵皮石斛葉部多糖在DPPH自由基清除方面比莖部多糖具有更大的優勢，表明鐵皮石斛葉部作為被人們忽視的副產物所具有的研究和利用價值。與鐵皮石斛葉部多糖相比，莖部多糖質量分數較低，因此需要考察不同的提取條件對葉部多糖的影響，從而提高其提取得率，為其實現工業應用提供參考。圖5為不同提取條件對葉部多糖得率的影響。結果顯示，隨著提取溫度由30℃提高至70℃，多糖得率亦由8.02%提高至9.02%，繼續提高溫度無助于多糖提取得率的提高（圖5a）；在不同提取時間中，葉部多糖的得率在提取時間由30 min提高至1 h有明顯的提高，但在提取1 h再增加提取時間對多糖得率基本無影響（圖5b）；對莖部多糖而言，料液比的不同會對其提取得率有較明顯的影響，但不同料液比對葉部多糖的影響較小（圖5c）。結果顯示鐵皮石斛不同部位進行多糖提取具有差異性，因此需要在今后的研究中探索適用于葉部多糖的最優提取方法，進一步提高葉部多糖的得率以實現產業化應用。

圖5 提取條件對葉部多糖得率的影響Fig.5 Influence of extracting conditions of DOLP on the yield of polysacchride

3 結語

鐵皮石斛是一種傳統的名貴中藥材，具有滋陰養胃、潤肺止咳和清熱明目之功效。由于人們健康意識的提升，天然保健產品受到人們青睞。目前鐵皮石斛常以莖部入藥，其“葉部”、“花”常大量在采收時舍棄，這對鐵皮石斛資源造成極大浪費。付玲珠[21]等通過小鼠試驗證實了以鐵皮石斛葉部和花配伍的和胃茶煎劑對胃腸運動有較明顯抑制作用，能解除腸痙攣。周桂芬等[18]檢測鐵皮石斛葉部和花中黃酮碳苷發現，鐵皮石斛葉部和花中的黃酮碳苷的質量分數明顯高于莖部，測定提取液的DPPH自由基清除能力，發現葉部提取液的自由基清除能力優于莖部。許莉[19]對疊鞘石斛不同部位進行薄層色譜、HPLC-DAD-ELSD聯用和GC-MS聯用技術比較分析得出，疊鞘石斛葉部、花與莖部均有一定相似度，且葉部與花中所含化學成分較莖部更為豐富，具有比較大的開發潛力。作者就鐵皮石斛莖部和葉部位做了比較研究，對鐵皮石斛主要活性成分多糖和生物堿而言，莖部質量分數大約為葉部3倍，而脂溶性成分和粗蛋白在葉部質量分數高于莖部質量分數。對初步純化得到的多糖，DOLP相比DOSP具有較低的純度、粘度和相對分子質量。單糖組成分析發現，DOSP和DOLP具有相似的單糖組成，但DOLP的單糖組成更豐富。測定DOSP和DOLP自由基清除能力發現，對羥基自由基清除能力，DOSP和DOLP具有相似水平，但對于DPPH自由基清除能力，DOLP明顯優于DOSP。最后，考察鐵皮石斛莖部和葉部多糖提取條件發現，DOSP和DOLP的最優條件相差很大，DOLP更易于提取，提取時應該差別對待。本研究結果證實了鐵皮石斛葉部具有很好的開發潛力，為鐵皮石斛資源綜合開發利用提供了一定的理論依據，但其生物活性及成分基礎有待進一步研究。

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Characterization and Bioactivity Analysis of Dendrobium officinale Stem and Leaf Polysacchride

ZHANG Youyuan1，2， CHEN Naiwei3， DING Zhongyang*1，2，GU Zhenghua2， ZHANG Liang1，2， SHI Guiyang2
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Shaoxin Rulin Biological Technology Co.，LTD，Shaoxing 312000，China）

Dendrobium officinale is a precious medicinal plant containingmany bioactive compounds and its stem was the main subject for structure and bioactivity research.In this study，the types and contents of active compounds in D.officinale stem and leaf were compared.Although D.officinale stem and leaf had similar compounds，the content of polysaccharide and dendrobine in stem was 2.71 and 3.02 times as high as in leaves，while the content of fat-soluble composition andcrude protein in leaves was significantly higher than that in stem.After monosaccharide composition analysis of purified stems and leaves polysaccharide，D.officinalestem polysaccharide （DOSP） was composed of mannose and glucose with mole ratio of 3.07：1.However，D.officinale leaf polysaccharide（DOLP） mainly contained mannose，glucose，galactose and arabinose with mole ratio 8.81∶1∶0.57∶0.37.In addition，the intrinsic viscosity and of DOSP was 56.26 dL/g and DOLP was 8.05 dL/g，while the corresponding molecular weight of DOSP and DOLP were 1 207 000 and 318 000，respectively.The results of free radical scavenging capacity shows that DOLP has higher DPPH free radical scavenging capacity than DOSP indicating a high potential for applied as theantioxidant.Finally the extracted condition of DOSP and DOLP was optimized by comparing various temperatures，extracted times and solid-liquid ratio to enhance the yield of this active compound.

Dendrobium officinale，polysaccharide，monosaccharide composition，DPPH free radical，polysaccharide extraction

TS 24

A

1673—1689（2017）09—0959—07

2015-03-19

國家863計劃項目（2012AA021505）；中央高校基本科研業務費專項資金項目（JUSRP51319B）。

*通信作者：丁重陽（1975—），男，江蘇南通人，工學博士，教授，博士生研究導師，主要從事發酵過程優化及食藥用真菌微生物技術方面的研究。E-mail：zyding@jiangnan.edu.cn

張又元，陳乃偉，丁重陽，等.鐵皮石斛莖部和葉部多糖的性質和活性[J].食品與生物技術學報，2017，36（09）：959-965.