油炸兔肉酶法預處理及改良劑配方優化

宋麗坤， 李 誠*， 楊 勇， 劉愛平， 卓永賢， 彭翔東， 付 剛， 黃子芮

（1.四川農業大學 食品學院，四川 雅安625014；2.四川哈哥集團有限公司，四川 樂山 614000）

油炸兔肉酶法預處理及改良劑配方優化

宋麗坤1， 李 誠*1， 楊 勇1， 劉愛平1， 卓永賢2， 彭翔東2， 付 剛1， 黃子芮1

（1.四川農業大學 食品學院，四川 雅安625014；2.四川哈哥集團有限公司，四川 樂山 614000）

以鮮兔肉為原料，利用蛋白酶預處理后，再使用改良劑來協同改善油炸兔肉產品口感。首先選用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶對原料進行前處理，通過單因素和正交試驗確定最佳酶解條件為：木瓜蛋白酶和胰蛋白酶用量復配比為300∶150，溫度為45℃，時間為60 min。然后再使用大豆蛋白、變性淀粉、小蘇打作為改良劑對產品品質進行改善，最終確定最佳的改良劑配方為小蘇打添加質量分數0.6%，變性淀粉添加質量分數10%，大豆蛋白添加質量分數4%。各因素的顯著性次序為：大豆蛋白量>變性淀粉量>小蘇打量。

油炸兔肉；改良劑；蛋白酶；加工工藝

我國是家兔養殖、兔肉生產加工、消費和貿易大國，其中油炸兔肉加工比較普遍[1]。但在傳統的油炸兔肉產品中，肉品的保水性不高，在油炸過程中，食品中大量的水分流失會造成肉質干硬、彈性不夠、口感粗糙、難咽難嚼等現象[2]，不宜于老年人和兒童人群的食用。而單純通過提高油炸兔肉的水分含量來改善其品質特性，會使產品因水分含量的增高而出現不夠香脆、難以保藏等問題，利用外源蛋白酶酶解處理如今已成為人們普遍使用的改善肉制品品質的手段之一[3]。木瓜蛋白酶[4-7]和胰蛋白酶[8-9]對肉制品具有嫩化作用，不僅可以改善油炸兔肉產品質構，還可以增加保水性，提高出產率[10-11]。所以通過酶法預處理和優化改良劑配方對油炸兔肉產品的肉品品質改善具有重要意義。作者研究了木瓜蛋白酶、胰蛋白酶嫩化兔肉的最佳工藝條件，分析酶解處理后蛋白質相對分子質量大小及兔肉微觀結構的變化。同時，利用小蘇打、大豆蛋白[12]、變性淀粉[13]作為品質改良劑對產品口感進行改善，優化改良劑配方。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮兔：購買于雅安鮮活批發市場；食鹽、雞蛋、味精、蜂蜜、香辣醬、胡椒粉、花椒粉、食用色拉油、香油等：雅安市售；木瓜蛋白酶（100 000 U/g）、胰蛋白酶（3 500 U/g）：諾奧科技發展有限公司；大豆蛋白、小蘇打、變性淀粉：均為食品級；鹽酸、無水乙醇、無水乙醚、石油醚、多聚甲醛：均為分析純。

1.2 儀器與設備

SC-3610低速離心機：安徽中科中佳公司；BT-124S電子天平：北京賽多利斯公司；DHG-9245A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋：國華電器公司；CX21顯微鏡：奧林巴斯公司；TA.XTPlus物性測試儀：英國Stable Micro System公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程 原料肉處理→嫩化→腌制→預煮→冷卻→成型切丁→真空油炸→包裝→殺菌→品質評定。

1.3.2 原料兔肉預處理操作要點

1）原料肉選擇：選擇健康無病的肉兔，按常規方法宰殺、清洗去血污、剔骨頭、修整，除去內臟、可見的脂肪、結締組織、筋腱等。

2）酶處理：將整理好的兔肉在一定的溫度、時間下對其進行酶解處理，處理方式為浸泡。

3）改良劑處理：先加入食鹽與兔肉全部混合均勻后，再加入一定量的品質改良劑，進行腌制。

1.3.3 酶處理條件優化 單因素實驗：木瓜蛋白酶、胰蛋白酶分別采用4個不同的添加量，木瓜蛋白酶酶活單位/兔肉肉用量梯度為 200、250、300、350 U/g，胰蛋白酶酶活單位/兔肉肉用量梯度為50、100、150、200 U/g； 作用溫度為 45、55、65、75 ℃，作用時間為30、60、90、120 min。處理后對水分質量分數、持水率、剪切力進行測定。根據木瓜蛋白酶、胰蛋白酶實驗結果得出的合適的用量、作用溫度、作用時間，以含水量、持水率、剪切力為主要評定指標，確定復合蛋白酶的最優作用條件。

1.3.4 品質改良劑優化 單因素實驗：小蘇打的添加質量分數分別設定為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%；變性淀粉的添加質量分數分別設定為5%、10%、15%、20%；大豆蛋白的添加質量分數分別設定為3%、4%、5%、6%，經感官評價確定小蘇打、變性淀粉、大豆蛋白添加量的適當水平范圍。根據單因素試驗結果，采用正交試驗優化改良劑配方，選擇三因素三水平L9（34）的正交試驗，以感官評價為主要指標，確定最佳配方。

1.3.5 測定指標

1）水分質量分數的測定：參照GB/T9695.15-2008測定。

2）持水力測定：參照楊寶進等[14]的測定方法。

3）肌纖維結構觀察：參照王水清等[16-17]的測定方法。

4）剪切力測定：采用食品質構儀進行測定[15]。探頭：HDP/BS，測試前速度 1.00 mm/s；測試后速度 0.5 mm/s；時間 5.00 s；測試速度 0.50 mm/s。室溫下進行檢測，每組試驗重復 4次，試驗結果為 4次測定結果的平均值。

5）SDS-PAGE電泳：稱取肉樣 10 g，加入 0.03 mol/L的磷酸緩沖液150 mL均質后，在4℃放置30 min，10 000 g離心20 min。取沉淀加入75 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液混合均勻，4℃下磁力攪拌30 min，同溫度下10 000 g離心20 min，取上清液。分離膠質量濃度為10 g/dL，濃縮膠質量濃度為5 g/dL。取待測蛋白質和2×樣品緩沖以1∶1混合，沸水中煮10min，上樣量 10 μL。 電泳電壓為 100 V，時間 4 h。

6）感官評定標準：通過查閱相關資料，并結合本實驗實際情況，制定如下所示的感官評價方案，成立10人感官評價小組（男女各5人）分別對產品的質地、色澤、滋味和氣味4項指標進行評價，確定產品整體可接受性，總分100分，各項感官評價標準見表1。

表1 感官評定標準Table 1 Sensory evaluation criteria

1.4 數據處理與分析

用Excel和SPSS19.0軟件進行數據處理和正交分析。

2 結果與分析

2.1 木瓜蛋白酶酶解單因素實驗

2.1.1 酶解用量對剪切力的影響 從圖1可以看出，木瓜蛋白酶對兔肉具有顯著的嫩化效果，當木瓜蛋白酶用量從0增加到300 U/g時，兔肉剪切力隨著木瓜蛋白酶用量的增加而下降，當木瓜蛋白酶用量從300 U/g增加到350 U/g時，兔肉的剪切力開始變大。

圖1 木瓜蛋白酶用量對剪切力的影響Fig.1 Effect of papain quantity on shear force

從圖2可以看出，木瓜蛋白酶用量在200 U/g時，兔肉的水分質量分數和持水率較低，隨著木瓜蛋白酶用量的逐漸增加，其水分質量分數和持水率逐漸增加，當木瓜蛋白酶用量在250 U/g到300 U/g時，兔肉的水分質量分數和持水率達到較高水平，之后又隨著木瓜蛋白酶用量的增加而降低。而木瓜蛋白酶用量過大造成剪切力上升，水分質量分數、持水率下降的原因可能是肌動球蛋白的過度裂解和結締組織過分降解造成的。由于嫩化過度，兔肉的完整形態遭到破壞，汁液流失，保水性降低，某些老化物質增加，硬度增加[8]。因此，綜合考慮木瓜蛋白酶用量對兔肉品質的影響，木瓜蛋白酶用量在300 U/g左右時，其對兔肉的嫩化效果最好。

圖2 木瓜蛋白酶用量對水分質量分數、持水率的影響Fig.2 Effect of papain quantity on water content and water holding capacity

2.1.2 酶解溫度對剪切力的影響 從圖3-4可知，當木瓜蛋白酶作用溫度從45℃升到65℃時，隨著溫度的升高，剪切力逐漸降低，水分質量分數、持水率也逐漸變大，而在55～65℃時變化顯著。當作用溫度超過65℃時，剪切力又逐漸變大，這可能是由于溫度過高導致木瓜蛋白酶部分失活[18]，致使兔肉嫩化效果變差，或者是由于溫度過高，松散的肌肉過度收縮，使肉變硬[19-20]。由此可以看出，作用溫度在55～65℃時，木瓜蛋白酶對兔肉的影響較大。

2.1.3 酶解時間對剪切力的影響 從圖5-6可知，當木瓜蛋白酶的作用時間從0-120 min遞增時，隨著作用時間的延長，兔肉的剪切力不斷減小，在90 min內木瓜蛋白酶對兔肉的影響較大，剪切力隨著時間的增加而大幅度減小，水分質量分數、持水率的變化較大；在60 min左右時，水分質量分數、持水率達到最大。當作用時間從90 min增加到120 min時，剪切力繼續下降，而水分質量分數、持水率基本沒有變化。說明此時木瓜蛋白酶對兔肉嫩度的影響逐漸減小，由于酶解時間過長，肌肉結構的完整形態遭到了破壞，肌纖維幾乎完全破裂，并不能真實反映肉的嫩度[15]。

圖3 木瓜蛋白酶作用溫度對剪切力的影響Fig.3 Effect of papain working temperature on shear force

圖4 木瓜蛋白酶作用溫度對水分質量分數、持水率的影響Fig.4 Effect of papain working temperature on water content and water holding capacity

圖5 木瓜蛋白酶作用時間對剪切力的影響Fig.5 Effect of papain working time on shear force

圖6 木瓜蛋白酶作用時間對水分質量分數、持水率的影響Fig.6 Effect of papain working time on water content and water holding capacity

2.2 胰蛋白酶酶解單因素實驗

2.2.1 酶解用量對剪切力的影響 從圖7-8可以看出，胰蛋白酶用量對兔肉的嫩化效果同木瓜蛋白酶作用效果相似。當胰蛋白酶用量從0增加到200 U/g時，兔肉的剪切力變化呈先下降后上升的趨勢，且在150 U/g時，剪切力最小，持水率最大。綜合胰蛋白酶對剪切力、持水率、水分質量分數影響的考慮，初步確定胰蛋白酶用量在150 U/g左右時，其對兔肉的嫩化效果最好。

圖7 胰蛋白酶用量對剪切力的影響Fig.7 Effect of trypsin quantity on shear force

圖8 胰蛋白酶用量對水分質量分數、持水率的影響Fig.8 Effect of trypsin quantity on water content and water holding capacity

2.2.2 酶解溫度對剪切力的影響 從圖9-10可知，胰蛋白酶作用溫度在65℃時，對剪切力的作用效果最好，在55℃升到65℃時，兔肉的水分質量分數、持水率均處于較高的水平。所以綜合考慮，胰蛋白酶的作用溫度在55～65℃時，其對兔肉的嫩化效果最為明顯。

圖9 胰蛋白酶作用溫度對剪切力的影響Fig.9 Effect of trypsin working temperature on shear force

圖10 胰蛋白酶作用溫度對水分質量分數、持水率的影響Fig.10 Effect of trypsin working temperature on water content and water holding capacity

2.2.3 酶解時間對剪切力的影響 從圖11-12可知，當胰蛋白酶的作用時間從0～120 min遞增時，隨著作用時間的延長，兔肉的剪切力不斷減小，而水分質量分數、持水率在60～90 min時處于較高水平，又由于隨著嫩化時間的增長，肌肉結構遭到完全破壞，并不能真實的反應兔肉的真實嫩度。所以綜合作用時間對剪切力、水分質量分數、持水率的影響，可以看出，當作用時間在60～90 min時，胰蛋白酶對兔肉的嫩化效果比較明顯。

圖11 胰蛋白酶作用時間對剪切力的影響Fig.11 Effect of trypsin working time on shear force

圖12 胰蛋白酶作用時間對水分質量分數、持水率的影響Fig.12 Effect of trypsin working time on water content and water holding capacity

2.3 雙酶作用條件優化

正交試驗設計及結果見表2-5。

表2 復合蛋白酶正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal experiment design and results of protease complex

續表2

表3 復合蛋白酶正交設計各因素方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal factors

表4 各因素回歸系數分析表Table 4 Variance analysis of regression coefficients

表5 各因素相關性矩陣Table 5 Correlation matrix

由方差分析、回歸分析得到：以水分質量分數為測定指標時，酶量、溫度的P值均小于0.05，在此水平下差異顯著，具有統計學意義。三個因素對水分質量分數的影響大小依次是：溫度>酶量>時間。F=5.664，P值小于0.05，說明擬合的線性回歸方程有統計學意義，建立水分質量分數（Y1）與酶量（X1）、溫度（X2）、時間（X3）三個因素的回歸模型方程為：

以持水率為測定指標時，酶量、溫度、時間的P值均大于0.05，且F=1.986，P值大于0.05，沒有統計學意義，不考慮各因素與持水率之間的線性關系。以剪切力為測定指標時，酶量、時間的P值均大于0.05，而溫度P值小于0.05，所以溫度在此水平下差異顯著，具有統計學意義。三個因素對剪切力的影響大小依次是：溫度>酶量>時間。F=6.793，P值小于0.05，說明擬合的線性回歸方程有統計學意義，建立剪切力（Y2）與酶量（X1）、溫度（X2）、時間（X3）三個因素的回歸模型方程為：

Y2=3 525.704+6.182Y2-65.339Y2+2.383Y3

從表5中可以看出，除用量與剪切力、溫度與剪切力、溫度與水分質量分數、用量與持水率、溫度與持水率的相關系數大于0.3以外，其他相關系數均小于0.3，所以各影響因素之間不存在相關性，可以排除各因素之間的交互作用。

通過正交化，獲得的最佳酶解條件是：木瓜蛋白酶和胰蛋白酶用量復配比為300∶150，作用溫度為45℃，作用時間為60 min。并通過驗證實驗，此條件下得到的水分質量分數為90.03%，持水率為78.13%，剪切力為 2 897 g·s。

2.4 酶解對相對分子質量大小的影響

圖13中1、2、3、4分別為未處理、木瓜蛋白酶處理、胰蛋白酶處理、復合蛋白酶處理的樣品，經蛋白酶處理后，2、3、4樣品均發生了降解，相對分子質量大小明顯發生了變化。樣品2的蛋白質相對分子質量主要集中在35 000～75 000之間，而樣品3的蛋白質相對分子質量比較分散，相對分子質量大小不一，這與木瓜蛋白酶、胰蛋白酶對肌纖維結構的不同降解作用有關。樣品4為復合蛋白酶作用效果圖，蛋白質主要為小相對分子質量蛋白質，與預測結果相符。

圖13SDS-PAGE電泳圖Fig.13 SDS-PAGE electrophoresis

2.5 肌肉組織結構觀察

采用組織學HE染色法對兔肉進行冰凍切片染色，在高倍顯微鏡下對染色結果進行觀察，結果見圖14-17。

圖14肌肉纖維完整，結構緊密有致，肌原纖維間隙均一，排列有序。圖15和圖16肌肉纖維結構之間有明顯縫隙和空洞，肌間隙變大，排列疏松、交錯，這與測得的兔肉剪切力下降、嫩度增大結果相吻合。圖17肌肉纖維斷裂，結構遭到破壞，排列雜亂無序。

2.6 品質改良劑優化實驗結果

從方差分析中：大豆蛋白添加量的P值小于0.05，在此水平下差異顯著，具有統計學意義。3個因素對口感的影響大小依次是：大豆蛋白>變性淀粉>小蘇打。F=2.813，P>0.05，說明三個因素與口感之間的線性關系并不顯著。通過正交優化，由k1j、k2j、k3j可確定各因素的最優水平為A2B2C2，即小蘇打添加質量分數為0.6%，變性淀粉添加質量分數為10%，大豆蛋白添加質量分數為4%。經過驗證實驗，結果與實驗吻合，見表6-8。

圖14 未處理樣品Fig.14 Untreated samples

圖15 木瓜蛋白酶處理樣品Fig.15 Papain treatment samples

圖16 胰蛋白酶處理樣品Fig.16 Trypsin treatment of samples

圖17 木瓜蛋白酶和胰蛋白酶處理樣品Fig.17 Papain and trypsin treated samples

表6 正交試驗設計及結果Table 6 Orthogonal experiment design and results

表7 正交設計各因素方差分析表Table 7 Variance analysis of orthogonal factors

表8 各因素回歸系數分析表Table 8 Variance analysis of regression coefficients

3 結 語

利用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶對兔肉進行了預處理，得出最佳酶處理條件：木瓜蛋白酶和胰蛋白酶用量復配比為300∶150，作用溫度為45℃，作用時間為60 min。從SDS-PAGE電泳圖中可知，經蛋白酶處理過的樣品，蛋白質發生了降解，相對分子質量大小發生了變化。另外，通過對酶處理后的肌肉纖維結構進行觀察，發現未處理樣品肌肉纖維結構緊密，排列有序；經木瓜蛋白酶、胰蛋白酶處理過的樣品肌間隙變大，排列疏松、交錯；經復合酶處理過的樣品肌纖維斷裂，排列雜亂、無序。然后再以大豆蛋白、變性淀粉、小蘇打作為改良劑對產品品質進行改善，確定最佳的改良劑配方為小蘇打質量分數0.6%，變性淀粉質量分數10%，大豆蛋白質量分數4%。各因素的顯著性次序為：大豆蛋白>變性淀粉>小蘇打。

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Optimization of Enzymatic Pretreatment Process and Modifier Formula for Fried Rabbit Meat

SONG Likun1， LI Cheng*1， YANG Yong1， LIU Aiping1，ZHUO Yongxian2， PENG Xiangdong2， FU Gang1， HUANG Zirui1
（1.College of Food，Sichuan Agriculture University，Yaan 625014，China；2.Sichuan Hage Group Co.Ltd，Leshan 614000，China）

In this work，the taste of fried rabbit meat products was mproved by enzymatic pretreatment process and using amendment.The enzymatic pretreatment was carried out by using papain and trypsin.By using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods，the optimal enzymatic pretreatment conditions were obtained as follows：the dosage ratio of papain and trypsin 300∶150，temperature 45 ℃，time 60 min.The product quality was improved by using soy protein，modified starch and baking soda，the optimal modifier formula was determined as 0.6%baking soda，10%modified starch and 4%soy protein.The sequence of the significance of these factors is as follows：soy protein dosage＞modified starch dosage＞baking soda dosage.

fried rabbit meat，modifier formula，protease，processing technology

TS 251.1

A

1673—1689（2017）09—0966—09

2015-04-07

國家星火計劃項目（2012GA810004）。

*通信作者：李 誠（1964—），男，四川三臺人，農學碩士，教授，博士研究生導師，主要從事畜產品加工與安全控制方面的研究。E-mail：lichenglcp@163.com

宋麗坤，李誠，楊勇，等.油炸兔肉酶法預處理及改良劑配方優化[J].食品與生物技術學報，2017，36（09）：966-974.