重組大腸桿菌產雙乙酰還原酶的發酵條件優化

邊雅倩， 許國超， 倪 曄

（江南大學 教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

重組大腸桿菌產雙乙酰還原酶的發酵條件優化

邊雅倩， 許國超， 倪 曄*

（江南大學 教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

光學純2，3-丁二醇是重要的手性合成砌塊。采用雙乙酰還原酶催化還原雙乙酰底物是一種合成光學純2，3-丁二醇的綠色方法。作者在搖瓶中對產雙乙酰還原酶重組大腸桿菌的發酵培養基及誘導條件進行了優化。優化后的發酵培養基組成為：甘油5 g/L，酵母浸膏10 g/L，魚粉蛋白胨 5 g/L，（NH4）2SO41.5 g/L，檸檬酸鈉 5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 2 g/L；優化后的誘導條件為37℃，IPTG終濃度為0.1 mmol/L。在優化培養基中，37℃和0.1 mmol/L IPTG條件下誘導發酵6 h，單位菌體（干重）產雙乙酰還原酶量達13.84 kU/g，產酶水平達33.65 kU/L，分別為基礎培養基的2.04和4.23倍，LB培養基的1.16和1.71倍。在此最優條件，在3 L發酵罐中進行了重組大腸桿菌產雙乙酰還原酶的驗證，發酵8 h時酶活最高，單位菌體產雙乙酰還原酶量達14.09 kU/g，產酶水平達64.62 kU/L。本研究為高效制備可用于不對稱還原合成光學純2，3-丁二醇的雙乙酰還原酶奠定了基礎。

重組大腸桿菌；雙乙酰還原酶；發酵培養基優化；誘導條件優化

2，3-丁二醇是一種非常重要的化合物，在防凍劑、油墨、香水和軟化劑等的合成中具有廣泛的用途，還可作為液體燃料以及用于制備甲乙酮及1，3-丁二烯[1]等化工原料。2，3-丁二醇有兩個手性碳原子，因此存在三種立體異構體：（2S，3S）-2，3-丁二醇，（2R，3R）-2，3-丁二醇及 meso-2，3-丁二醇。 三種單一立體構型的2，3-丁二醇由于存在不同手性基團而具有不同的性質，均可作為合成精細化學品、手性藥物及手性試劑的重要砌塊，例如：（2R，3R）-2，3-丁二醇可用于合成光學活性的2-甲基-1，4-丁二醇，而（2S，3S）-2，3-丁二醇對動物體內腺苷酸環化酶活性具有抑制作用[2]。鑒于其重要的應用價值，近些年國內外許多研究者對其合成進行了研究。據報道許多微生物能夠發酵生產2，3-丁二醇，但是產生的2，3-丁二醇一般至少為兩種立體異構體的混合物[3]，因而其應用具有一定的局限性。利用基因工程改造的微生物細胞進行全細胞生物催化可生產單一立體構型的2，3-丁二醇，因此受到越來越多的關注。其中，將雙乙酰還原酶在大腸桿菌中異源過量表達，并以雙乙酰為底物，通過連續兩步還原生成 （2S，3S）-2，3-丁二醇， 是合成光學純2，3-丁二醇的綠色、高效方法之一。

李理想等從陰溝腸桿菌Enterobacter cloacae中克隆了一個2，3-丁二醇脫氫酶 （雙乙酰還原酶）基因并異源表達于大腸桿菌中，構建了含有雙乙酰還原酶的重組大腸桿菌。以雙乙酰為底物，經全細胞催化合成了（2S，3S）-2，3-丁二醇，產量達 26.8 g/L[4]。Wang Z等從紅平紅球菌Rhodococcus erythropolis中克隆了一個雙乙酰還原酶基因并在大腸桿菌中進行異源表達，該酶同時具有氧化1-苯乙醇的活力，可通過添加1-苯乙醇實現輔酶NADH的循環。利用該重組酶不對稱還原雙乙酰生產 （2S，3S）-2，3-丁二醇，產量最高可達5.24 g/L[5]。本課題組從地衣芽孢桿菌Bacillus lincheniformis中克隆了一個具有高活性和選擇性的雙乙酰還原酶基因，將其成功異源表達于大腸桿菌中。為了實現重組酶在大腸桿菌的大量表達，降低重組酶制備的成本，作者對基因工程菌 Escherichia coli BL21 （DE3）/pET24abdh的發酵培養基及誘導條件進行優化，并在發酵罐中進行了重組大腸桿菌的放大培養。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 E.coli BL21（DE3）/pET24a-bdh，作者所在實驗室構建并保存。

1.1.2 培養基 種子培養基為LB培養基（g/L）：胰蛋白胨 （OXOID）10， 酵母提取物（OXOID）5，NaCl 10；發酵基礎培養基（g/L）：葡萄糖 5，酵母浸膏 5，魚粉蛋白胨5，NaCl 5。使用250 mL搖瓶，裝液量為30 mL。將上述基礎培養基中碳源、氮源及無機鹽替換成不同的成分以進行發酵培養基優化。

1.1.3 試劑 發酵培養基各種成分：購自國藥集團藥業股份有限公司；IPTG、卡那霉素：購自生工生物工程股份有限公司。

1.2方法

1.2.1 培養方法 將甘油管保藏菌接入LB培養基中，于37℃、200 r/min過夜培養，按體積分數5%轉接入發酵（基礎）培養基中，于37℃、200 r/min繼續培養至OD600約為0.6～0.8時，加入0.2 mmol/L IPTG，于30℃誘導培養6 h。

1.2.2 細胞光密度分析 將菌懸液適當稀釋，于分光光度計（600 nm）測定其吸光值。

OD600=讀數×稀釋倍數。

1.2.3 菌體生物量的測定 取相同體積不同濃度的菌體，測定其OD600后，于8 000 r/min下離心10 min，棄上清液后用去離子水懸浮菌體，再離心，棄上清液后，將菌體放置于70℃烘干至恒質量。菌體質量濃度（g/L）與OD600呈線性關系，結果見圖1。

y=0.331x-0.088 7 （R2=0.999 6）

其中 x為 OD600，y為菌體質量濃度（g/L）。

圖1 菌體質量濃度與OD600的線性關系Fig.1 Relationship between the dry cell weight and the OD600

1.2.4 菌體破碎 誘導培養結束后，離心收集菌體，用 7 mL 磷酸鉀緩沖液（100 mmol/L，pH 6.0）懸浮菌體，使用超聲波破碎儀對菌體破碎10 min，結束后于4℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液進行酶活測定。

1.2.5 酶活測定 使用酶標儀（美國BioTek）測定雙乙酰還原酶的活力，酶活測定體系如下（200 μL）：檸檬酸鈉緩沖液（100 mmol/L，pH 5.0），NADH 1 mmol/L，雙乙酰5 mmol/L，適量上清粗酶液。通過測定340 nm處吸光值的下降來計算雙乙酰還原酶的活力。酶活定義如下：在上述條件下，每分鐘催化1 μmol NADH氧化所需要的酶量。

2 結果與討論

2.1 發酵培養基的優化

2.1.1 碳源對菌體生長及產酶的影響 研究了4種較廉價的碳源：葡萄糖、甘油、蔗糖、可溶性淀粉（均5 g/L）對重組大腸桿菌的生長及產酶的影響，結果見表1。并且通過SDS-PAGE觀察不同碳源對雙乙酰還原酶可溶性表達的影響，結果見圖2。

表1 不同碳源對重組大腸桿菌菌體生長及產酶的影響Table 1 Effect of different carbon sources on cell growth and diacetyl reductase production of recombinant E.coli

結果表明：以葡萄糖為碳源時菌體質量濃度最高（1.41 g/L），單位菌體產酶量最低（12.37 kU/g），可見葡萄糖容易被菌體利用進行生長，但不利于產酶；而以蔗糖和可溶性淀粉為碳源時，單位菌體產酶量雖然較高，但是不利于菌體生長（<1.0 g/L）；而以甘油為碳源時，菌體產量為1.35 g/L，且單位菌體產酶量及產酶水平均是最高的。同時SDS-PAGE顯示，4種碳源對重組蛋白質的可溶性表達沒有影響。因此，最終選擇甘油為碳源。

圖2 不同碳源對重組雙乙酰還原酶可溶性表達的影響Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant enzyme expressed in different carbon sources

通過單因素優化，確定了最佳的甘油添加質量濃度，結果見圖3。可知，當甘油質量濃度為5 g/L時，單位菌體產酶量及產酶水平均已達到最高，繼續增加甘油對單位菌體產酶量及產酶水平無顯著影響，因此確定最適甘油質量濃度為5 g/L。

圖3 不同質量濃度的甘油對產酶的影響Fig.3 Effectofdifferentglycerolconcentration on diacetyl reductase production

2.1.2 氮源對菌體生長及產酶的影響 無機氮源相比于有機氮源更易于被大腸桿菌所利用，促進菌體的生長和產酶。但是以無機氮源為惟一氮源時菌體的生長緩慢[6-7]，因此在含有機氮源培養基（酵母浸膏5 g/L、魚粉蛋白胨5 g/L）的基礎上，研究無機氮源（NH4）2SO4和 NH4Cl（各 1.5 g/L）對菌體的生長及產酶的作用，結果見表2。

表2 不同無機氮源對菌體生長及產酶的影響Table 2 Effect of inorganic nitrogen sources on cell growth and diacetyl reductase production

表2顯示，無機氮源添加后，菌體生長和產酶均有提高，菌體產量由1.60 g/L提高至2.17、1.92 g/L，產酶水平由 25.51 kU/L提高至 33.29、31.84 kU/L，但單位菌體產酶量無明顯變化。由此可知，（NH4）2SO4和NH4Cl的添加可以明顯地促進大腸桿菌的生長和產酶，可以作為有機氮源的必要補充。與 NH4Cl相比，添加（NH4）2SO4后單位菌體產酶量略微提高，由于重組雙乙酰還原酶是胞內酶，單位菌體產酶量的提高對于降低生物催化反應的催化劑用量非常重要，因此最終選擇（NH4）2SO4為無機氮源。進一步研究3種有機氮源牛肉膏、酵母浸膏、魚粉蛋白胨及其組合的影響，結果見表3。

表3 不同有機氮源對菌體生長及產酶的影響Table 3 Effect of organic nitrogen sources on cell growth and diacetyl reductase production

由表3可知，添加單一有機氮源牛肉膏和魚粉蛋白胨及這兩種氮源組合均不利于菌體生長，菌體質量濃度均小于1.0 g/L，而酵母浸膏可明顯促進大腸桿菌菌體生長及產雙乙酰還原酶，在僅添加酵母浸膏時，菌體質量濃度和單位菌體產酶量分別為1.40 g/L和24.84 kU/g。進一步將酵母浸膏分別與牛肉膏和魚粉蛋白胨進行組合，在酵母浸膏與魚粉蛋白胨各為5 g/L時，單位菌體產酶量最高（26.32 kU/g），考慮到雙乙酰還原酶是胞內酶，選擇酵母浸膏與魚粉蛋白胨的組合單位菌體產酶量更高，且工業級魚粉蛋白胨的價格低于牛肉膏，因此最終確定有機氮源為酵母浸膏和魚粉蛋白胨。另外，通過SDSPAGE觀察重組蛋白在不同有機氮源中的可溶性表達情況，見圖4。

圖4 不同有機氮源對重組蛋白可溶性表達的影響Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant enzyme expressed in different nitrogen sources

圖4顯示，不同有機氮源對重組蛋白的可溶性表達沒有影響，因此最終確定酵母浸膏與魚粉蛋白胨的組合作為發酵培養基的有機氮源。參照LB培養基中有機氮源的總質量濃度為15g/L（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L），在控制總氮源質量濃度為15 g/L下，進一步研究酵母浸膏與魚粉蛋白胨的不同比例對菌體生長及產酶的影響，結果見圖5。可知，當酵母浸膏與魚粉蛋白胨的比例為2∶1時，單位菌體產酶量及產酶水平均為最高，因此確定酵母浸膏10 g/L、魚粉蛋白胨5 g/L作為最佳有機氮源添加量。

2.1.3 無機鹽對菌體生長及產酶的影響 在確定碳源及氮源的種類和添加量后，使用正交方法對無機鹽種類及質量濃度進行了優化。無機鹽對微生物有非常重要的生理功能，例如：滲透壓的維持、酶的激活劑、pH的穩定、細胞組成成分等。研究了4種重組大腸桿菌發酵產酶中較常用的無機鹽（檸檬酸鈉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl）對菌體生長及產雙乙酰還原酶的影響，以產酶水平為考察指標，正交實驗設計與結果見表4。

圖5 酵母浸膏與魚粉蛋白胨比例對產酶的影響Fig.5 Effect of ratio between yeast extract and peptone on diacetyl reductase production

表4 無機鹽優化正交實驗設計與結果Table 4 Design and results of orthogonal experiment for optimization of inorganic salts

從正交實驗結果看，檸檬酸鈉對產酶的影響最顯著（R 值為 15.00），其次為 NaCl（R 值為 3.42），MgSO4·7H2O和KH2PO4對產酶的影響最小。檸檬酸是TCA循環的關鍵物質，因此推測檸檬酸鈉的添加可以為細胞生長提供能量，也可促進細胞的產酶[8]。實驗結果也顯示，細胞干重隨檸檬酸鈉濃度的增大而增大，產酶水平及單位菌體產酶量也逐漸提高。其中最優組合為 A3B1C1D1，即檸檬酸鈉 5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 2 g/L。

2.1.4 不同培養基中菌體生長及產酶比較 經過優化，確定了最優發酵培養基的組成：甘油5 g/L，酵母浸膏 10 g/L，魚粉蛋白胨 5 g/L，（NH4）2SO41.5 g/L，檸檬酸鈉 5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 2 g/L。進一步比較了重組菌在基礎培養基、發酵優化培養基、LB培養基中菌體生長及產酶情況，結果見表5。

表5 不同培養基中菌體生長及產酶比較Table 5 Comparison ofcellgrowth and enzyme production in different medium

表5顯示，與基礎培養基和LB培養基相比，發酵相同時間優化培養基中菌體生長及產酶均得到了提高，菌體干重2.43 g/L，單位菌體產酶量達13.84 kU/g，產酶水平達33.65 kU/L。雖然單位菌體產酶量的數值低于氮源優化的結果，但是產酶水平相當，主要是由于批次間的操作差異所致。采用該優化的國產培養基后，單位菌體產酶量和產酶水平分別為LB進口培養基的1.16和1.71倍，是基礎培養基的2.04和4.23倍。

2.2 誘導條件的優化

2.2.1 誘導溫度的優化 在25、30、37℃三個誘導溫度下對重組大腸桿菌產雙乙酰還原酶的表達進行了優化，結果見圖6。37℃下單位菌體產酶量與產酶水平均最高。通過SDS-PAGE觀察三個溫度下重組蛋白的可溶性表達情況，結果見圖7。蛋白質的可溶性表達都較好。由于37℃下發酵時間短，產酶量高，因此最終選定37℃為最適誘導溫度。

圖6 誘導溫度的優化Fig.6 Optimization of inducing temperature

2.2.2 誘導劑IPTG濃度的優化 對4種IPTG濃度 0.1、0.3、0.5、1.0 mmol/L 進行了優化，結果見圖8。

結果顯示，高濃度的IPTG對菌體產雙乙酰還原酶不利，當濃度為0.1 mmol/L時，產酶水平最高（40.29 kU/L），但隨著IPTG濃度的逐漸增加，菌體生長受到抑制且產酶水平有所降低。考慮到發酵成本的經濟性，最終確定最佳誘導劑濃度為0.1 mmol/L。

圖7 不同誘導溫度下蛋白質表達情況Fig.7 SDS-PAGEanalysisofrecombinantenzyme expressed under different inducing temperatures

圖8 IPTG濃度的優化Fig.8 Optimization of IPTG concentration

2.3 重組大腸桿菌在3 L發酵罐中的發酵培養

發酵培養基及誘導條件優化結束后，在3 L發酵罐上進行重組大腸桿菌產雙乙酰還原酶的驗證。發酵罐的裝液量為1 L，將過夜培養的種子液（OD600=2.16）按體積分數5%接種至發酵罐，37℃下培養。當菌體生長到OD600=3.09（約3 h）時，加入IPTG（終濃度0.1 mmol/L）進行誘導培養。培養過程中，控制溶氧水平在10%～30%之間，pH在7.0左右。在培養過程中通過流加碳源及氮源來保證菌體生長和產酶所需的營養，補加碳源體積分數50%、甘油約20 mL，且加IPTG誘導后即停止。以恒定的速度補加氮源（酵母浸膏30 g/L、魚粉蛋白胨15 g/L、（NH4）2SO44.5g/L），直至發酵結束。定時取樣測定OD600及酶產量（kU/L），結果見圖 9。

圖9 發酵罐中菌體生長和產酶曲線Fig.9 Cell growth and diacetyl reductase production in the fermenter

圖9顯示，培養8 h時菌體生長進入穩定期，此時酶活最高，單位菌體產酶量達14.09 kU/g，產酶水平達64.62 kU/L，均高于搖瓶水平。繼續延長培養時間后菌體生長緩慢，產酶水平不再繼續提高。目前，尚無關于重組大腸桿菌產雙乙酰還原酶的培養基及發酵條件優化的報道。作者采用國產培養基替換進口培養基后，仍然可達到比進口培養基更高的酶產量，降低了重組雙乙酰還原酶的制備成本。

3 結語

經過優化培養基各組分后，確定重組大腸桿菌產雙乙酰還原酶的最適發酵培養基組分為：甘油5 g/L，酵母浸膏 10 g/L，魚粉蛋白胨 5 g/L，（NH4）2SO41.5 g/L，檸檬酸鈉 5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 2 g/L；最適誘導溫度為 37℃，IPTG 濃度為0.1 mmol/L。在此條件下進行搖瓶發酵，單位菌體產酶量和產酶水平分別為LB進口培養基的1.16和1.71倍，基礎培養基的2.04和4.23倍。并在3 L發酵罐對最優發酵培養條件進行了驗證。本研究為制備可用于不對稱還原法合成光學純2，3-丁二醇的雙乙酰還原酶奠定了基礎。

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Optimization of Fermentation Conditions for Production of Diacetyl Reductase Using Recombinant Escherichia coli

BIAN Yaqian， XU Guochao， NI Ye*
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Optically pure 2，3-butanediol is one of the important building blocks.Bioreduction of diacetyl using diacetyl reductase is an environmentally friendly method for chiral 2，3-butanediol production.The medium components and induction conditions of diacetyl reductase produced by recombinant Escherichia coli were optimized in flasks.The optimal medium composition for the production of diacetyl reductase was listed as follows：glycerol 5 g/L，yeast extract 10 g/L，peptone 5 g/L，（NH4）2SO41.5 g/L，sodium citrate 5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L and NaCl 2 g/L.The optimal induction conditions were listed as follows：37 ℃ and 0.1 mmol/L IPTG.After induced for 6 h under the optimized conditions，the enzyme activities reached to 13.84 kU/g dry cell weight and 33.65 kU/L，which were 2.04 and 4.23 folds of those in basic medium，1.16 and 1.71 folds ofthose in LB medium.In a 3 L fermenter，under the optimized conditions，the maximum enzyme activities achieved at 14.09 kU/g and 64.62 kU/L after cultured for 8 h，which were both higher than those in flasks.This study provides useful guidance on the highly efficient preparation of diacetyl reductase by recombinant Escherichia coli for the preparation of chiral 2，3-butanediol.

recombinantEscherichia coli，diacetylreductase，medium optimization，induction condition

Q 93

A

1673—1689（2017）09—0944—07

2015-03-25

國家自然科學基金項目（21276112）；國家973計劃項目（2011CB710800）。

*通信作者：倪 曄（1975—），女，江蘇無錫人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事生物催化和酶工程方面研究。

E-mail：yni@jiangnan.edu.cn

邊雅倩，許國超，倪曄.重組大腸桿菌產雙乙酰還原酶的發酵條件優化[J].食品與生物技術學報，2017，36（09）：944-950.