尿酸酶自組裝空心納米微球體外穩(wěn)定性

鄧 雪， 胡雪原， 何 丹， 晏子俊， 周云莉， 張景勍

（重慶醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，重慶 400016）

尿酸酶自組裝空心納米微球體外穩(wěn)定性

鄧 雪， 胡雪原， 何 丹， 晏子俊， 周云莉， 張景勍*

（重慶醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，重慶 400016）

制備載尿酸酶（Uricase，UOX）聚乙二醇-透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid-graft-poly（ethylene glycol），HA-g-PEG）/羥丙基-β-環(huán)糊精（Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin，HPCD）自組裝空心納米微球（HA-g-PEG/HPCD self-assembly hollow spheres encapsulated uricase，UHPHD），并研究其體外穩(wěn)定性。制備UHPHD，并測(cè)定其包封率、粒徑及Zeta電位。再分別從最適溫度、最適pH、熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和抗胰蛋白酶水解能力初步考察游離UOX和UHPHD的差異。結(jié)果：UHPHD的包封率為（62.17±2.94）%，粒徑和Zeta電位分別為（299.60±13.05）nm和（-45.10±2.75）mV。UHPHD和UOX最適溫度均為40℃，最適pH均為8.5。體外穩(wěn)定性結(jié)果顯示，UHPHD的體外穩(wěn)定性明顯高于UOX。

尿酸酶；穩(wěn)定性；自組裝空心納米微球

尿酸是機(jī)體嘌呤代謝的終產(chǎn)物，經(jīng)腎臟隨尿液排出體外。尿酸及其鹽類在水中溶解度很低，在某些病理情況下，由于嘌呤代謝紊亂，血液中尿酸積累過(guò)多，會(huì)導(dǎo)致高尿酸血癥，繼而引發(fā)痛風(fēng)綜合癥[1]。尿酸酶（Uricase，UOX）能夠催化尿酸氧化生成尿囊素、過(guò)氧化氫和二氧化碳[2]。UOX專一性強(qiáng)，催化效率高，能夠在短時(shí)間內(nèi)有效降低患者體內(nèi)的尿酸水平[3]。20世紀(jì)90年代，尿酸酶已作為治療痛風(fēng)的藥物首先在歐洲上市。但是作為一種外源性的蛋白質(zhì)，UOX存在著易被體內(nèi)酶水解，穩(wěn)定性低、半衰期短等蛋白質(zhì)藥物的共同缺點(diǎn)，更嚴(yán)重的是它還存在著抗原性較強(qiáng)，易產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)等問(wèn)題，因此大大限制了其臨床使用[4]。

自組裝空心納米微球是一種新型的藥物載體。Ha等[5]人將L-天冬酰胺酶包載于海藻酸鈉-聚乙二醇/α-CD形成的空心納米囊中。由于形成的囊膜具有半滲透性，酶的底物和催化產(chǎn)物能順利通過(guò)囊膜，而酶不能自由通過(guò)從而提高了酶的穩(wěn)定性、拓寬了酶的最適溫度和最適pH。為了克服UOX的缺點(diǎn)，擴(kuò)大其臨床應(yīng)用，作者以聚乙二醇-透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid-graft-poly ethylene glycol，HA-g-PEG）/羥 丙 基 -β-環(huán) 糊 精 （Hydroxypropyl-betacyclodextrin，HPCD）為載體，自組裝形成空心納米微球（HA-g-PEG/HPCD self-assembly hollow spheres encapsulated uricase，UHPHD）， 并 著 重 考 察 了UHPHD的體外穩(wěn)定性，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

UOX：美國(guó)Sigma公司；尿酸：英國(guó) Alfa Aesar公司；羥丙基-β-環(huán)糊精：武漢國(guó)邦達(dá)醫(yī)藥化工有限公司；乙醚為分析純。

AB204S電子分析天平：瑞士Mettler Toledo儀器公司；RE 52 AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；TGL-16B臺(tái)式高速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；UV-7504 PC型紫外分光光度計(jì)：上海欣茂儀器有限公司；ZS90型激光粒度電位儀：英國(guó)馬爾文公司；PHS-3C型pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ-2200B型水浴型超聲儀：江蘇昆山市超聲儀器有限責(zé)任公司；Sephadex G-200層析柱：上?？笊锛夹g(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 UHPHD的制備 采用Meng等[6]的方法制備UHPHD。先配制1.0%的HA-g-PEG溶液和6.0%的HPCD溶液；將一定量的UOX加入到2 mL的HA-g-PEG溶液中，緩慢溶解；然后將2 mL含有UOX的HA-g-PEG溶液緩慢滴加入6 mL的HPCD溶液中。開始滴加時(shí)，溶液變輕微的渾濁，表明開始有空心納米球形成，繼續(xù)在10℃條件下磁力攪拌2 h，即得 UHPHD。

1.2.2 UHPHD的包封率的測(cè)定 按照參考文獻(xiàn)報(bào)道方法，采用凝膠柱分離-考馬斯亮藍(lán)法[7]測(cè)定包封率。吸取0.5 mL的UHPHD，上Sephadex G-200層析柱，用pH 8.5的Bicine-NaOH緩沖液以1 mL/min流速洗脫分離UHPHD和UOX。接收UHPHD部分，取其中100 μL，加入乙醚破乳后，再加入考馬斯亮藍(lán)，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度值（AUHPHD）。以同法處理的未過(guò)柱的UHPHD，同法測(cè)定吸收度值（A總）。包封率（%）=AUHPHD/A總×100%，重復(fù)3次。

1.2.3 UHPHD的粒徑和Zeta電位的測(cè)定 取少量UHPHD混懸液，以1∶10比例稀釋3倍后，在25℃下用激光粒度電位儀測(cè)定UHPHD的粒徑和Zeta電位。

1.2.4 UHPHD和UOX最適溫度和最適pH的測(cè)定將尿酸溶于50 mmol/L硼酸-硼砂（pH 8.5）緩沖液中，分別于20～70℃的水浴中預(yù)熱10 min后，在25℃下按照Z(yǔ)hou等[8]方法測(cè)定UHPHD和UOX的活性，繪制溫度-活性曲線圖。在硼酸緩沖體系中分別配制pH 6.5～9.5的尿酸溶液，分別在最適溫度條件下預(yù)熱10 min后測(cè)定UHPHD和UOX的活性，繪制pH-活性曲線圖。

1.2.5 UHPHD和UOX熱穩(wěn)定性的測(cè)定 分別取UHPHD和UOX各2 mL，置于55℃的水浴中，在第0、1、2、3、4、5 小時(shí)取 200 μL，測(cè)定 UHPHD 和 UOX的活性，結(jié)果以活性保留百分?jǐn)?shù)進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 UHPHD和UOX貯存穩(wěn)定性的測(cè)定 將UHPHD和UOX（UOX的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL）避光密封貯存于 4 ℃條件下， 分別于第 0、1、2、4、7、10、14、20、28天取出， 測(cè)定 UHPHD 和 UOX 的活性，結(jié)果以活性保留百分?jǐn)?shù)進(jìn)行計(jì)算。

1.2.7 UHPHD和UOX酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定 分別取UHPHD和UOX（UOX的質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL）100 μL， 加入 pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的緩沖液稀釋3倍，置于40℃水浴中放置40 min，取出測(cè)定UHPHD和UOX的活性。以UHPHD在pH 8.5時(shí)的酸堿穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果為100%，計(jì)算其余各點(diǎn)的相對(duì)活性。

1.2.8 UHPHD和UOX抗胰蛋白酶水解能力的測(cè)定 分別取1 mL UHPHD和UOX（UOX質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL），加入等體積0.2 mg/mL胰蛋白酶溶液混合，然后置于 37 ℃水浴中，在 0、10、20、30、40、50、60 min分別取出，測(cè)定UHPHD和UOX的活性，結(jié)果以活性保留百分?jǐn)?shù)進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 UHPHD的包封率、粒徑及Zeta電位

制備3批UHPHD，經(jīng)檢測(cè)，平均包封率為（62.17±2.94）%，平均粒徑為（299.60±13.05）nm，Zeta電位為（-45.10±2.75）mV。UHPHD的粒徑分布和電位見圖1。

圖1 UHPHD的粒徑分布圖和zeta電位分布圖Fig.1 Size distribution profiles and zeta potential profiles of UHPHD

2.2 UHPHD和UOX的最適溫度

UHPHD和UOX的最適溫度均為40℃，如圖2所示。結(jié)果顯示，UHPHD在20～70℃ 時(shí)活性均高于UOX，其中40℃時(shí)UHPHD活性是UOX的116.31%。

2.3 UHPHD和UOX的最適pH值

pH測(cè)定結(jié)果見圖3。UHPHD和UOX的pH從5.0到8.5時(shí)，活性逐漸升高，從pH 8.5到pH 9.5時(shí)活性逐漸降低，故UHPHD和UOX的最適pH值為8.5。此時(shí)，UHPHD活性是UOX的1.4倍。在pH 5.0～9.5范圍內(nèi)，UHPHD的活性均高于游離UOX，表明UHPHD能明顯提高UOX的活性。

圖2 UHPHD和游離UOX的最適溫度（n=3）Fig.2 Optimal temperature of UHPHD and free UOX，（n=3）

圖3UHPHD和游離UOX的最適pH（n=3）Fig.3 Optimal pH of UHPHD and free UOX（n=3）

2.4 UHPHD和UOX熱穩(wěn)定性的測(cè)定

UHPHD和UOX的熱穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見圖4，UHPHD在55℃水浴中放置5 h后，酶活性仍保持為80%以上，而UOX在相同的條件下，活性由100%下降到16.76%。3 h時(shí)，UOX活性下降到50%以下，而UHPHD酶活性仍保留為85.31%。

圖4 UHPHD和游離UOX的熱穩(wěn)定性（n=3）Fig.4 Thermal stabilities of UHPHD and free UOX（n=3）

2.5 UHPHD和UOX貯存穩(wěn)定性的測(cè)定

UHPHD和UOX的貯存穩(wěn)定性測(cè)定的結(jié)果見圖5。在4℃避光密封貯存條件下，UHPHD的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于UOX。當(dāng)游離UOX在第28天活性保留值降至23.72%時(shí)，UHPHD仍保留有57.78%的活性；UHPHD在第10天時(shí)活性保留值為81.66%時(shí)，游離UOX則低于50%。綜上，UHPHD有更好的貯存穩(wěn)定性。

圖5 4℃條件下UHPHD和UOX貯存穩(wěn)定性的測(cè)定（n=3）Fig.5 Storage stabilities of UHPHD and free UOX incubated at 4 ℃（n=3）

2.6 UHPHD和UOX酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定

UHPHD和UOX的酸堿穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，在pH 5.0～9.5中，UHPHD活性保留最小值為55.64%，游離UOX活性保留最大值僅為66.77%，最小值為20.47%。在此pH范圍內(nèi)，UHPHD活性保留值均高于UOX。表明UHPHD較游離UOX有更好的耐溶液酸堿變化的能力。

圖6 UHPHD和UOX酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定（n=3）Fig.6 pH stabilities of UHPHD and free UOX（n=3）

2.7 UHPHD和UOX抗胰蛋白酶水解能力的測(cè)定

UHPHD和UOX的抗胰蛋白酶水解能力測(cè)定見圖7。UOX的酶活性快速下降，在60 min時(shí)，活性僅保留了10.33%，幾乎喪失活性。相反，UHPHD活性仍保留在50%以上，表明UHPHD相比于UOX有更好的抗酶解能力。

圖7UHPHD和UOX抗胰蛋白酶水解能力的測(cè)定Fig.7 Proteolytic stabilities of UHPHD and free UOX

3 結(jié)語(yǔ)

本研究表明，UOX熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和抗胰蛋白酶水解能力均明顯低于UHPHD，其原因可能是酶蛋白中的反應(yīng)基團(tuán)或者蛋白質(zhì)中的一些高級(jí)結(jié)構(gòu)直接暴露于外部環(huán)境中。過(guò)高或者過(guò)低的溫度、過(guò)酸或者過(guò)堿的環(huán)境、貯存時(shí)間的延長(zhǎng)以及胰蛋白酶的水解使得酶分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和性質(zhì)改變，導(dǎo)致酶活力的降低甚至喪失。據(jù)報(bào)道，Li等[9]將葡萄糖氧化酶包裹于羧甲基魔芋苷葡聚糖-聚乙二醇/α-環(huán)糊精自組裝形成的納米球中，提高了葡萄糖氧化酶的穩(wěn)定性，且載體膜具有半滲透性及生物相容性。作者制備的HA-g-PEG/HPCD自組裝空心納米微球是一種新型的藥物載體，將UOX包裹于HA-g-PEG/HPCD自組裝空心納米微球后，由于載體對(duì)酶蛋白具有一定的保護(hù)作用，降低了外界環(huán)境變化引起的酶分子構(gòu)象改變的幾率，因而使得酶的穩(wěn)定性獲得了提高。

作者從熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和抗胰蛋白酶水解能力方面分別對(duì)UHPHD和UOX的體外穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，豐富了UOX的研究?jī)?nèi)容，也為UHPHD的體內(nèi)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。由本研究可看出，UHPHD有提高UOX體外穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)。

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會(huì)議名稱(中文)：第九屆中國(guó)工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展高峰論壇

所屬學(xué)科：生物技術(shù)與生物工程

開始日期：2017-11-06

結(jié)束日期：2017-11-08

所在城市：天津市 和平區(qū)

主辦單位：中國(guó)科學(xué)院科技促進(jìn)發(fā)展局、中國(guó)生物工程學(xué)會(huì)

承辦單位：中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所、中科育成（天津）科技發(fā)展有限公司

聯(lián)系人：吳崇明

聯(lián)系電話：022-24828776

E-MAIL：biocap@tib.cas.cn

會(huì)議網(wǎng)站：http://www.cas.cn/xs/201707/t20170710_4608053.shtml

會(huì)議背景介紹：“中國(guó)工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展高峰論壇”是中國(guó)科學(xué)院科技促進(jìn)發(fā)展局聯(lián)合國(guó)家發(fā)改委高技術(shù)產(chǎn)業(yè)司、科技部中國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心、中國(guó)生物工程學(xué)會(huì)等部門和單位共同精心打造的國(guó)內(nèi)唯一集政府、企業(yè)、科研、教育、金融等元素為一體的工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域品牌盛會(huì)。“中國(guó)生物工業(yè)投資大會(huì)”由中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所策劃發(fā)起，國(guó)內(nèi)首個(gè)生物工業(yè)領(lǐng)域以資本、技術(shù)、產(chǎn)業(yè)為核心的專業(yè)性、商務(wù)型投資會(huì)議，為促進(jìn)工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域“技術(shù)、產(chǎn)業(yè)、資本”深度融合搭建嶄新平臺(tái)。 2017年，中國(guó)工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展高峰論壇專注深耕工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域第十年，將與中國(guó)生物工業(yè)投資大會(huì)合并召開，力求辦成特色互補(bǔ)、效應(yīng)倍增的行業(yè)盛會(huì)！

“第九屆中國(guó)工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展高峰論壇暨第二屆中國(guó)生物工業(yè)投資大會(huì)”將組織“技術(shù)創(chuàng)新”和“項(xiàng)目路演”、“企業(yè)展覽”三大板塊內(nèi)容，著重探討工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域“合成生物技術(shù)”、“酶工程與生物催化”、“細(xì)胞工廠”、“生物計(jì)算與設(shè)計(jì)”、“高通量篩選裝備與技術(shù)”等議題，并甄選處于不同階段的優(yōu)秀生物工業(yè)項(xiàng)目進(jìn)行路演，發(fā)布《中國(guó)工業(yè)生物技術(shù)白皮書暨中國(guó)生物工業(yè)投資分析報(bào)告2017》，還將設(shè)立“年度創(chuàng)新先鋒獎(jiǎng)”、“年度科技轉(zhuǎn)化獎(jiǎng)”及“年度綠色企業(yè)獎(jiǎng)”等獎(jiǎng)項(xiàng)，同時(shí)開展小組討論、一對(duì)一洽談等活動(dòng)。大會(huì)將采取多種組織形式，加強(qiáng)互動(dòng)交流，歡迎在線注冊(cè)報(bào)名參會(huì)！

In Vitro Stability of Uricase Self-Assembly Hollow Nanospheres

DENG Xue， HU Xueyuan， HE Dan， YAN Zijun， ZHOU Yunli， ZHANG Jingqing*
（College of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

To prepare the self-assembly hollow nanospheres of hyaluronic acid-graft-poly（ethylene glycol）（HA-g-PEG）and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin （HPCD）containing uricase （U HPCD）and study their stability in vitro.UHPCD were prepared and the entrapment efficiency，size and zeta potential of UHPCD were detected.The optimum temperature，optimum pH，thermal stability，storage stability，pH stabilities and proteolytic stabilities of UOX and UHPHD were measured.The entrapment efficiency of UHPHD was（62.17±2.94）%.The average particle size was（299.60±13.05）nm，and the zeta potential was （-45.10±2.75） mV.The optimal temperatures for UHPHD and U0X were 40 ℃ ，the optimal pH values were 8.5.UHPHD significantly enhanced the stability of free UOX in vitro.

uricase，stability，self-assembly hollow nanosphere

R 944.9

A

1673—1689（2017）09—0933—05

2015-04-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30973645）；重慶市首批高等學(xué)校優(yōu)秀人才資助計(jì)劃項(xiàng)目（渝教人（2009）2號(hào)文件）。

*通信作者：張景勍（1973—），女，重慶市人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事藥物新劑型與新技術(shù)方面的研究。E-mail：zjqrae01@163.com

鄧雪，胡雪原，何丹，等.尿酸酶自組裝空心納米微球體外穩(wěn)定性[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（09）：933-937.