利用PiggyBac轉座子系統快速控制GPI錨定蛋白的表達

Matabaro Emmanuel， 柳藝石， 張慧杰， 高曉冬， 藤田盛久

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

利用PiggyBac轉座子系統快速控制GPI錨定蛋白的表達

Matabaro Emmanuel， 柳藝石， 張慧杰， 高曉冬， 藤田盛久*

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

GPI錨定蛋白的合成是一個發生在內質網中多步驟、多基因參與的過程。PIGK是GPI錨定蛋白轉酰胺酶復合物的一個催化亞基，負責把GPI前體轉移到蛋白質上。作者在人體胚胎腎細胞（HEK 293）中獲得了PIGK敲除的細胞株，敲除PIGK的細胞不能表達GPI錨定蛋白。利用piggyBac（PB）轉座子系統，在細胞中重新插入PIGK基因，細胞膜表面的GPI錨定蛋白恢復表達。實驗成功構建了HEK293pB-PIGK細胞株并命名為G36，通過引入PB轉座酶或FLP重組酶，可以控制GPI錨定蛋白的表達。本系統可以快速調控細胞表面蛋白質的表達并能夠用于基礎研究和工業應用。

GPI錨定蛋白；PiggyBac轉座子；PIGK

動物細胞的很多膜蛋白都是通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定在細胞膜表面且GPI錨定蛋白質的生物合成在真核細胞中高度保守[1-3]。在動物細胞中，有超過150種蛋白質屬于GPI錨定蛋白，包括細胞表面受體，細胞黏附分子和細胞表面水解酶等[2，4]。GPI在內質網中由22個稱作磷脂酰肌醇糖（PIG）的基因參與合成并轉移到蛋白質上[5]。C末端含有 GPI修飾序列的蛋白質在 PIGK、GPAA1、PIGS、PIGT和PIGU組成的GPI轉酰胺酶復合物的識別下，被剪切并轉移到GPI上[6-7]。在這個復合物中，PIGK是GPI轉酰胺酶的催化亞基。GPI蛋白轉運過程中，GPI上的脂質和糖鏈結構會發生重組，該過程對GPI錨定蛋白的轉移效率和與細胞膜上脂筏的結合相當重要。GPI合成途徑中的基因突變會導致細胞膜表面的GPI錨定蛋白表達水平下降和結構缺陷[5，8]。當把GPI修飾序列加到分泌蛋白的C端時，可以把該蛋白轉變成GPI錨定蛋白。所以通過GPI修飾可以把不同的重組蛋白表達到細胞膜表面[9]。和原核生物重組蛋白表達系統相比，真核生物的蛋白修飾更符合藥用蛋白質的生產[10]。因此，開發基于真核生物的表達系統具有重要意義。

發現于粉紋夜蛾中的piggyBac（PB）轉座子系統[11-12]，是一種由PB介導的“剪切，粘貼”型基因轉移系統。通過激活PB（PBase），PB轉座子能夠精確的從供體DNA上切除，并且不留下任何基因印跡[13-14]。與其他轉座子系統相比，PB轉座子作為良好的基因篩選和基因插入工具，廣泛應用到包括原生生物，植物，昆蟲和脊椎動物等很多物種上[15-16]。

作者利用PB轉座子的優點來研究細胞膜表面的GPI錨定蛋白。首先成功構建了能夠控制GPI錨定蛋白表達的系統，該系統不僅可以用來研究GPI的生物合成途徑，而且還能夠用于重組GPI錨定蛋白的表達生產。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人體胚胎腎細胞HEK 293用含有10%胎牛血清（FCS）的 DMEM 培養基（Gibco，Life technologies，USA）培養，培養條件為 37 ℃、5%CO2。

1.2 PIGK敲除細胞株的構建

利用CRISPR/Cas9系統敲除[17]參與GPI錨定蛋白生物合成過程中的PIGK基因，通過E-CRISP（http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/） 網 站 設 計 敲 除PIGK的一對目標序列caccGCTCTTGTCCTTCGGC AGCGTGG和aaacCCACGCTGCCGAAGGACAAGAG C，并通過Bbs I位點連接到pX330-EGFP質粒上，得到pX330-EGFP-PIGK-KO.按照Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）的說明書，質粒瞬時轉染到培養在6孔板的HEK 293細胞中，3 d后細胞分選儀收集GFP陽性細胞，分選得到的細胞培養8 d后做限制性稀釋獲得單克隆細胞株。

1.3 PB轉座子系統回補質粒的構建

為了構建PB轉座子介導的PIGK基因回補質粒，以質粒pPB-FRT-PGKp-PurodTK作為骨架質粒，該質粒含有一個PGK啟動子，一個多克隆位點，一個牛生長激素（GH）聚腺苷酸信號，SV40啟動子和一個purodTK基因，兩側是PB末端重復序列和翻轉酶識別位點（FRT）。PCR擴增PIGK基因。以限制性內切酶處理并純化PCR擴增片段，用連接酶（Ligation Mix，Takara，JP） 連接到載體 pPB-FRTPGKp-PurodTK的EcoR I和Not I位點，構建出pPB-FRT-PurodTK-PIGK質粒。質粒pCMV-hyPBase：桑格研究所Kosuke Yusa教授贈送；pCAG-FLPe-IRES-puro：從Addgene上購買。

1.4 流式細胞分析

用胰酶（Sangon，CN）消化處理并收集細胞，用磷 酸 鹽 緩 沖 液 （phosphate buffered saline，PBS，Sangon，CN）洗滌。取5×105個細胞重懸于流式細胞液 FACS（PBS，1%BSA 和 0.1%NaN3）中，之后用一抗 anti-CD59 或 anti-Flag（10 μg/mL）冰上孵育 25 min。之后用FACS洗滌兩次，二抗用帶有熒光信號PE共軛結合的山羊抗老鼠免疫球蛋白IGg冰上孵育25 min，然后再用FACS洗滌兩次，FACS溶液重懸細胞并用BD Accuri C6（BD，USA）流式細胞分析儀分析。

1.5 巢式PCR檢測PB插入的拷貝數

質粒pPB-FRT-PurodTK-PIGK和pCMV-hyPBase共轉到PIGK敲除細胞中，轉染2 d后，用含有嘌呤霉素（puromycin，InvivoGen，USA）的培養基篩選陽性細胞，之后限制性稀釋獲得單克隆，分析單克隆細胞株的PB-FRT-PurodTK-PIGK的插入位點和插入拷貝數。用基因組提取試劑盒（Promega）提取細胞基因組，限制性內切酶Hae III（NEB，#R0108S）酶切降解基因組DNA，37℃酶切反應12～16 h， 通過巢式PCR技術以引物Spl-P1，CGAATCGTAACCGTTCGTACGAGAA 和 3PB-1st，TATACAGACCGATAAAACACATGCGT做第一輪PCR反應，以Spl-P2 TCGTACGAGAATCGCTGTCC TCTCC和3PB-2nd CGCATGATTATCTTTAACGTA CGTCACAA做第二輪PCR反應來擴增被PB轉座子插入的位點[18]。獲得的PCR產物，通過2 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳分析PB插入的拷貝數，只有一個插入位點的細胞株G36用做后續試驗的出發細胞株。

1.6 PB轉座子的移除

為了從G36細胞株中移除轉座子，當細胞在6孔板中長到 90%時分別轉染 4 μg的 pCMV-hyPBase或pCAG-FLPe-IRES-puro質粒。轉染后2 d 加入 1 μmol/L 核苷類似物 1-（2-deoxy-2-fluoro-1-D-arabinofuranosyl）-5-iodouracil（FIAU），之后每天更換培養基，持續7 d[19]。之后流式分析PB元件是否移除，巢式PCR再次確認PB轉座子被成功切除。

2 結果與分析

2.1 GPI錨定蛋白突變細胞的構建

目前研究蛋白質表達的熱點就是找到一株能夠用來研究感興趣的生物合成途徑的穩定細胞株。為此，作者開發了一個新的系統，該系統能夠很容易的控制GPI錨定蛋白的表達。首先，利用CRISPR/Cas9系統在HEK 293細胞中敲除PIGK基因，PIGK是GPI轉酰胺酶復合物的催化亞基，在內質網中負責GPI的轉移[20-21]。在PIGK突變的細胞中，蛋白質不能夠被GPI修飾，直接通過內質網介導的蛋白質降解途徑（ERAD）降解[5]。

和預期的結果一樣，PIGK敲除的HEK 293細胞，流式細胞分析檢測不到細胞表面大量表達的GPI錨定蛋白CD59，見圖1。通過擴增敲除區域的DNA片段并測序分析，在第一個外顯子的切除位點插入了一個核苷酸堿基。插入的堿基導致基因發生移碼突變，同時使基因失去活性，見圖2。在整個培養過程中，PIGK敲除細胞沒有表現任何生長和形態上的缺陷。

圖1 利用CRISPR/Cas9系統敲除PIGK基因Fig.1 PIGK KO by CRISPR/Cas9

圖2 PIGK敲除細胞的性狀Fig.2 Genotype of PIGK-KO cells

2.2 通過PB轉座子控制GPI錨定蛋白的表達

PIGK基因的回補通過攜帶PB轉座子的質粒實現。質粒pPB-FRT-PurodTK-PIGK由PB和FRT序列包含的PIGK基因和purodTK篩選標簽構成，見圖3（a）。細胞共轉染表達PB轉座酶的質粒pCMV-hyPBase和 pPB-FRT-PurodTK-PIGK，將PIGK插入基因組中，2 d后流式分析轉染效率，見圖3（b）。隨后，嘌呤霉素培養基篩選8 d獲得PIGK回補細胞株。流式分析經過篩選后的細胞，流式峰圖明顯的從左側移到右側，說明很多細胞的GPI錨定蛋白CD59表達得以恢復，見圖3（c）。

圖3 PB系統介導的PIGK回補Fig.3 PIGK rescued by PB system

2.3 確定PB的拷貝數和插入位點

作者試圖獲得一株像野生型HEK293表達GPI錨定蛋白的回補細胞株，為此，經過嘌呤霉素篩選，限制性稀釋獲得一些單克隆細胞。在這些細胞中，CD59表達水平與野生型相似。然而，當PB轉座子插入時，同一克隆細胞有可能有多個插入基因[22-23]。為了后續實驗，需要獲得只有一個PB插入位點的細胞。巢式PCR確定插入拷貝數和插入基因[18]，在這些細胞株中，成功找到一株能夠正常表達CD59且只有一個PB拷貝的細胞株，并命名為HEK293pB-PIGK-G36，見圖4。測序結果顯示，含有PIGK的PB元件插入位于13號染色體上的kelch類似（KLHL1）基因的內含子TTAA序列中。

圖4 G36細胞株中PB轉座子的插入位點Fig.4 PB transposon insertion site in G36 cells

2.4 G36細胞株PB的移除恢復細胞PIGK突變性狀

PB轉座子系統的在基因工程中的優點就是可以通過表達PB轉座酶很容易的將PB轉座子移除，因此把插入位點恢復到起始狀態并不留任何痕跡。一開始插入基因組的PIGK兩側的包含了FRT和PB轉座子序列，所以PIGK可以被FLP重組酶和PB 轉座酶再次切除，見圖 5（a）。 除此之外，puroΔTK可以用來作為基因插入或移除的篩選標簽。PIGK和puroΔTK移除的細胞對核苷類似物1-（2-deoxy-2-fluoro-1-D-arabinofuranosyl）-5-iodouracil（FIAU）具有抗性。當FLP重組酶或PB轉座酶轉染G36細胞，緊接著用FIAU處理，流式分析細胞表面的CD59，結果顯示處理后的細胞又恢復到PIGK敲除狀態，說明PIGK被準確的切除，見圖5（b）。這些數據表明，G36細胞可以很容易的從GPI錨定蛋白表達狀態轉化到GPI錨定蛋白非表達的狀態，見圖6。

圖5 PB轉座酶或FLP重組酶調控GPI錨定蛋白的表達或不表達Fig.5 Conversion of GPI-positive to GPI-negative cells by induction of PBase or FLP recombinase

圖6 GPI錨定蛋白的免疫印跡結果Fig.6 Western-blot results of GPI-anchored protein CD59

3 結 語

作者開發了一個基于PB轉座子系統調控細胞膜表面GPI錨定蛋白表達的系統。利用CRISPR/Cas9，成功獲得PIGK敲除細胞。由于PIGK負責在內質網中把GPI轉移到新生蛋白質上面[21]，所以PIGK敲除細胞表面不能表達GPI錨定蛋白。通過PB轉座子系統，PIGK恢復表達。獲得了一株PB回補的PIGK突變細胞株HEK293pB-PIGK-G36，該細胞株可以很容易的從GPI錨定蛋白表達細胞到不表達的轉化。在這個細胞株中，過表達PB轉座酶和FLP重組酶可以再次把PIGK移除。當細胞表達PB轉座酶時，整個PB轉座子都能夠被移除，然而表達FLP重組酶時，來自于質粒上的部分片段仍會殘留[24]。本研究構建的細胞株可以調控GPI錨定蛋白的表達，該系統可以用來研究GPI錨定蛋白的生理功能，如結合并響應病原微生物、毒素的感染。通常情況下細胞就是通過細胞膜表面的GPI錨定蛋白識別一些細菌和毒素。除此之外，該系統還可以通過依賴于PIGK基因，將感興趣的蛋白以GPI錨定蛋白的形式表達到細胞膜表面，也可以再次從細胞膜表面移除。該系統將會有很高的應用價值。

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Quick Conversion From GPI-Positive to GPI-Negative Cells Using piggyBac Transposon System

Matabaro Emmanuel， LIU Yishi， ZHANG Huijie， GAO Xiaodong， Morihisa Fujita*
（School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The biosynthesis of GPI is carried out in the endoplasmic reticulum （ER） through multiple steps and many genes are involved in the reactions.PIGK is one of the subunits of the catalytic domain of the GPI transmidase complex，responsible for the transfer of GPI moiety on protein.In this study，we generated a PIGK-knockout （KO） HEK 293 cell line，which showed no surface expression of GPI-anchored proteins（GPI-APs）.By mediation of piggyBac（PB） transposon system，we rescued the PIGK gene in PIGK-KO cells，which showed the recovery of the surface expression of GPI-APs.We successfully established a HEK 293 cell line，HEK293pB-PIGK，named G36，which can be converted from GPI-AP positive to negative cells by the introduction of PB transposase or FLP recombinase.Our system is useful to modulate surface proteins quickly and canbe applied for both basic and applied researches.

GPI-anchor proteins，piggyBac（PB），PIGK

Q 786

A

1673—1689（2017）09—0927—06

2016-03-10

國家自然科學基金項目（31400693）；江蘇省自然科學基金項目（BK20140141）；中央高校基本科研業務費（JUSRP51508）。

*通信作者：藤田盛久（1979—），男，日本人，理學/農學博士，教授，博士研究生導師，主要從事細胞分子生物學及細胞糖生物學方面的研究。E-mail：fujita@jiangnan.edu.cn

Matabaro Emmanuel，柳藝石，張慧杰，等.利用PiggyBac轉座子系統快速控制GPI錨定蛋白的表達[J].食品與生物技術學報，2017，36（09）：927-932.