克氏梭菌和釀酒酵母混合培養提高己酸產量

嵇 翔 ， 徐 巖 *， 穆曉清 ， 葛向陽

（1.江南大學 工業微生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

克氏梭菌和釀酒酵母混合培養提高己酸產量

嵇 翔1，2， 徐 巖*1，2， 穆曉清1，2， 葛向陽1，2

（1.江南大學 工業微生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

為了提高克氏梭菌8022產己酸的能力，縮短發酵周期，作者將該株菌與釀酒酵母進行了混合培養，并進一步分析混合培養體系提高己酸產量的機理。研究表明：在用發酵罐對己酸菌進行純培養時己酸菌產量可達6.35 g/L，與釀酒酵母共培養時，產酸達到7.09 g/L，產酸提高了12.5%，且到達最大產酸的周期縮短了約48 h。相關參數的分析表明，釀酒酵母在共培養過程中主要通過提高乙酸到丁酸的轉化速率，從而提高己酸的產量。通過分析溶氧值和微生物生長參數，表明引起這一變化的主要原因是共培養時釀酒酵母的生長提高了共培養體系的厭氧水平，促進丁酸的生成和轉化，從而提高了己酸的產量。

克式梭菌；釀酒酵母；純培養；共培養；己酸

目前文獻報道的己酸菌[1-3]，主要是克魯氏梭狀芽孢桿菌（Clostridium kluyveri）[4]，簡稱克氏梭菌。 是我國主要香型之一的濃香型白酒中主要產酸微生物，由它代謝產生的己酸與發酵產生的乙醇作用生成己酸乙酯，構成了濃香型大曲酒的主體香氣物質，是影響白酒品質的重要因素之一[5-6]。所以克氏梭菌的產酸能力直接影響著濃香型白酒的產品品質。克氏梭菌是一類絕對厭氧的細菌，細胞呈現桿狀，帶芽孢，革蘭氏染色陽性，在乙酸鈉培養基中可利用乙醇和乙酸合成丁酸和己酸并產生氫氣[7]。通常可采用厭氧培養箱培養，簡單的液態發酵則可通過深層培養或提高裝液量的方式來保證其厭氧環境。

目前，濃香型白酒生產工藝主要是采用固態發酵，發酵工藝和體系較為復雜，不方便模擬研究。而采用新型的“無土發酵”即液態發酵產酸，可以簡化發酵流程，縮短周期，對研究混合菌種產酸非常有效。此前一些研究者報道了液態發酵提高己酸產量的策略，如洋河酒廠將克氏梭菌8022及異常漢遜酵母1295巴氏AS1.41混合培養可使己酸產量達到4.4 g/L。三井酒業通過對發酵車間窖泥的己酸菌分離純化，篩選到8株己酸菌，最高一株產己酸可達3.0 g/L。早前的山東曲阜酒廠曾簡要介紹了通過生香酵母和己酸菌共同發酵能促進己酸菌生長和產酸，產酸最高可達4.5 g/L。一般國內的產己酸水平在4～6 g/L，如何通過調控己酸合成代謝途徑，進一步提高己酸產量，是當前己酸發酵的研究重點[8]。

近年來，混合培養體系，特別是與酵母菌混合培養的產酸、產酶體系引起了廣泛的關注。研究表明，在與酵母菌共培養的混合發酵體系中，通過其中的協同作用機制，達到促進目標產物合成的目的。而關于和釀酒酵母共培養提高產酸卻少見報道。為了進一步提高克氏梭菌的己酸合成能力，作者將己酸菌和釀酒酵母進行了混合培養，明顯提高了該株菌的己酸合成速率，通過發酵罐液態發酵的方法比較了在己酸菌純培養和與酵母共培養[9-12]的情況下，其產酸和其他參數的變化情況，通過實驗數據分析，初步探究了產酸提高的機理，為進一步研究和優化提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 克氏梭菌8022：江蘇洋河酒廠股份有限公司窖泥中分離得到，江南大學釀造微生物與應用酶學實驗室保藏；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：江南大學釀造微生物與應用酶學實驗室篩選并保藏。

1.1.2 培養基 乙酸鈉改良培養基（g/dL）：NaAc 0.6，酵母膏 0.5，K2HPO30.04，MgSO40.02，（NH4）2SO40.05;乙醇體積分數2%（培養基滅菌后加入），pH 7.0，121℃滅菌20 min。

YPD 培養基（g/dL）：酵母膏 1，蛋白胨 2，葡萄糖2，115℃滅菌 30 min。

1.1.3 主要試劑 叔戊酸（GR）:美國SIGMA公司；乙酸鈉 （AR）:國藥集團化學試劑有限公司；乙醇（GR）:上海安普科學儀器有限公司；正己酸（GR）:美國SIGMA公司；正丁酸（GR）:美國SIGMA公司；磷酸氫二鉀（AR）:國藥集團化學試劑有限公司；硫酸鎂（AR）:國藥集團化學試劑有限公司；硫酸銨（AR）:國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 主要設備和儀器 天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超凈臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；恒溫培養箱：華粵行儀器有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋：日本TOMY KOGYO公司；氣相色譜儀 7890A：安捷倫公司；紫外可見分光光度計：光尼柯（上海）儀器有限公司；漩渦混合器：上海琪特分析儀器有限公司;發酵罐（7L）：New Brunswick，Eppendorf BioFlo/CelliGen 115。

1.2 試驗方法

1.2.1 己酸菌發酵培養 將己酸菌發酵液以體積分數10%接入乙酸鈉培養基中，于37℃下恒溫培養。由于己酸菌是厭氧菌，發酵液裝瓶量應控制在90%以上并使錐形瓶密閉。己酸菌擴大培養：將己酸菌發酵液以體積分數10%接入乙酸鈉培養基中，于37℃下恒溫培養4 d后，保藏在4℃冰箱中。

1.2.2 酵母培養方法 挑單菌落接入經滅菌的YPD培養基100 mL/500 mL三角瓶，溫度30℃，轉速250 r/min，發酵16 h，加無菌水稀釋使得酵母菌液濃度為108～2×108CFU/mL，取適量菌液離心后加入醋酸鈉培養基，接種體積分數20%。

1.2.3 氣相法測揮發酸條件 GC[13]條件：柱型號CP-WAX57CB（50 m長，內徑0.25 mm，膜厚0.2 mm）；柱溫：采用程序升溫，初始溫度為50℃，保持2 min，升溫速率為15℃/min，終止溫度為230℃，保持15 min；進樣器溫度為150℃，檢測器溫度為250℃；載氣（高純氮）流速為44 mL/min，氫氣流速為30 mL/min，空氣的流速為400 mL/min；進樣量為1 μL。前處理方法為取適量發酵液，加0.1 mol/L稀硫酸調至pH 2，膜濾（0.22 μL水系）加1%內標叔戊酸，振蕩混勻放入1 mL離心管，存于4℃冰箱。

1.2.4 高效液相色譜測乙醇 檢測器：示差折光檢測器；流動相：0.05 mmol/L濃硫酸，流速0.6 mL/min，洗脫時間30 min。前處理方法為：取樣品0.5 mL加1 mL 三氯乙酸，4 ℃沉淀 30 min，過膜（0.22 μL 水系）[15-16]。

2 結果與討論

2.1 己酸菌純培養條件下的產酸情況

如圖1所示，克氏梭菌8022純培養時，前體物質丁酸大約第96 h開始產生，從第120 h開始合成己酸，此時，丁酸的生成速率大于其消耗速率，故此階段丁酸濃度逐步上升，直至約120 h。而己酸產生直至240 h左右趨于穩定。產物丁酸從開始產生到第130 h左右達到峰值，約4.5 g/L。此后，丁酸的消耗速率大于生成速率，開始呈現下降趨勢，大約144 h左右趨于穩定。從圖中可以看出，本菌株在純培養條件下的己酸最大產量可達6.35 g/L。

2.2 克氏梭菌8022與與釀酒酵母共培養條件下己酸合成

如圖2所示，克氏梭菌8022與釀酒酵母共同培養后，前體物質丁酸的產酸時間由原來的第96 h變為第48 h，最大己酸產量也由原來的120 h提前為96 h左右。最大己酸產量提高到約7.09 g/L左右。

圖1 克氏梭菌純培養產酸過程曲線Fig.1 Acid yield curve of pure culture

圖2 共培養對產酸水平的影響Fig.2 Acid yield curve of co-culture

2.3 共培養提高產酸的作用機制初步分析

為了進一步分析混合培養體系提高己酸產量的機理，作者進一步分析了共培養過程中克氏梭菌與釀酒酵母菌數的變化及整體生物量的關系。

圖3 共培養對生物量和菌數的影響Fig.3 Biomass and microbial content of co-culture

從圖3可以看出，前期由于酵母接種體積分數較大，因此酵母數量占優勢，鏡檢發現大量圓球狀酵母以及梭狀己酸菌。隨后釀酒酵母菌數量開始逐步減少，而且前72 h左右數量迅速遞減，這可以歸結于釀酒酵母難以利用培養基中碳源。而此時，己酸菌開始生長，鏡檢結果顯示到48 h時能觀察到游動的梭狀桿菌，并且數量逐步增加。此后己酸菌進入對數生長期開始大量增殖，并于120 h左右菌數達到最大值，約1.4×108cfu/mL，之后己酸菌進入穩定期，此時酵母已基本趨于穩定，鏡檢顯示始終有少量酵母存在發酵液體系中。這也說明了己酸菌改良培養基不適合酵母菌的生長，但是在共培養的條件下能少量存活，而且外加的酵母對己酸菌的生長沒有明顯負面影響。

前期三角瓶實驗已初步驗證酵母共培養提高產酸不是由于乙醇和營養物質的緣故 （數據未提供），我們用發酵罐在線監測手段觀測其發酵過程的參數變化，主要包括pH和溶氧值DO的變化，見圖4-5。可以看出，克氏梭菌8022純培養的溶氧值波動較大，實驗結果表明共培養的溶氧普遍低于純培養時的值，整個厭氧環境的不同很可能導致了產酸和代謝上的差異，這也說明深層發酵產酸明顯優于低裝液量發酵。無論哪種培養方式，兩種培養方式的pH都呈現較緩慢的下降趨勢，并最終穩定在5.9左右，這與在500 mL小三角瓶中的預實驗結果基本相同。

圖4 發酵罐純培養的溶氧和pH變化曲線Fig.4 DO and pH curve of pure culture

圖5 發酵罐共培養溶氧和pH變化曲線Fig.5 DO and pH curve of co-cuture

從圖6可以看出，初始乙醇質量濃度約為16 g/L，此后因消耗而逐步下降，但是無論純培養還是共培養，乙醇的變化趨勢沒有明顯差異。結果表明酵母無氧呼吸產生的乙醇不是提高己酸產量的主要因素。圖7表明了底物乙酸的消耗情況。當克氏梭菌8022純培養的時候，乙酸作為底物在前240小時呈現整體下降中間略有回升的趨勢，這主要歸結于部分乙醇被氧化為乙酸的緣故。克氏梭菌8022與釀酒酵母共培養時，乙酸消耗速率和最終向己酸的轉化率都有所提高，第80小時開始乙酸快速消耗轉化為丁酸，由此可見厭氧環境的改善也一定程度促進了乙酸的轉化率[17]。

圖6 培養方式對乙醇消耗量的影響Fig.6 Effect of culture mode on ethanol consumption

圖7 培養方式對乙酸消耗量的影響Fig.7 Effect of culture mode on acetic acid consumption

為了進一步明確共培養體系中己酸的合成代謝機制，我們以發酵前240小時底物產物皆基本趨于穩定時為終點，計算了純培養和共培養條件下，乙醇、乙酸、丁酸、己酸的平均消耗速率[18]和最大值。

從表1可以看出，純培養體系中己酸的合成速率普遍低于共培養的速率。其中，乙酸和丁酸的轉化速率有明顯差異，共培養比純培養提高了50%以上，乙醇的轉化速率有較小影響，最終的結果是促進了己酸的產生，由原來的6.35 g/L提高到7.09 g/L，產酸速率從 0.60 g/（L·d）提高到 0.69 g/（L·d）。 這說明厭氧環境對乙酸轉化為丁酸，丁酸轉化為己酸這一代謝途徑有比較大的影響，而乙醇不是主要影響因素。

表1 純培養和共培養產（底）物反應速率及峰值Table 1 Reaction rate and peak of product（substrate）when pure colture and co-colture

3 結 語

克氏梭菌是絕對厭氧細菌，在傳統白酒窖池體系中，它是以混合菌種形式存在于窖泥中。傳統白酒很早就提出“以糟養窖、以窖養糟”的說法，其實質就是窖泥中克氏梭菌與酒醅中酵母的協同作用機制。作者將克氏梭菌和釀酒酵母共同培養，并通過發酵罐試驗，在線監測DO、pH等值，并通過氣相液相色譜離線測定產物底物的質量濃度以及混合培養體系生物量的分析，初步證明了酵母對克氏梭合成己酸的提高機制：主要是改善了厭氧環境，促進了乙酸及丁酸的轉化率，而不是乙醇的轉化率，即乙酸到丁酸和丁酸到己酸的代謝途徑通過厭氧環境的改善得到了強化，最終使己酸的最大產量從6.35 g/L提高到7.09 g/L，提高了11.7%，到達最大產酸的周期縮短了48 h。本研究為白酒液態發酵技術的改造與提升提供重要的參考依據。

[1]QIAO Lin.The characteristics of caproic acid bacteria and their culture[J].Liquor Making，1997，2：27-28.（in Chinese）

[2]XIE Guopai.Culture methods of caproic acid bacteria&the formation of its main linked product[J].Liquor Making Science and Technology，1997，2：27-28.（in Chinese）

[3]GUO Yishan，ZHEN Da，CHEN Maobing.Optimization for industrial amplification cultural conditions of caproic acid mixed culture[J].Liquor Making，2010，37（1）：39-42.（in Chinese）

[4]DING Xuesong，ZHAO Hui.Research progress in Clostridium kluyveri[J].Science and Technology of Food Industry，2012，33（15）：401-405.（in Chinese）

[5]MIAO Zijian，WANG Xingchu，LIU Xiaoning.Isolation and purification ofcaproic acid bacteria from pit mud&study of its acid-producting capacity[J].Science and Technology of Food Industry，2012（11）：79-81.（in Chinese）

[6]XU Jun.Application of caproic acid bacteria functional liquid in luzhou-flavor liquor production[J].Science and Technology of Food Industry，2012（1）：77-78.（in Chinese）

[7]HONG B D，GIIN Y A T，JING Y W.Caproate formation in mixed-culture fermentative hydrogen production[J].Bioresource Technology，2010（101）：9550-9559.

[8]REN Jing，MA Rongshan，GUAN Wei，et al.Studies of acid produce by caproic acid bacteria in pit mud[J].Liquor Making，2006，33（1）：41-43.（in Chinese）

[9]GE Xiangyang，HE Qian，ZHANG Weiguo.Enhancement of L-Lactic acid production in lactobacillus casei from jerusalem artichoke tubers by kinetic optimization and citrate metabolism[J].Microbiol Biotechnol，2010，20（1）：101-109.

[10]KENEALY W R，CAO Y，WEIMER P J.Production of caproic acid by cocultures of ruminal cellulolytic bacteria and Clostridium kluyveri grownon cellulose and ethanol[J].Appl Microbiol Biotechnol，1995，44：507-513.

[11]LeiXu，ULRIKE T.Immobilized anaerobic fermentation for bio-fuel productionby Clostridium co-culture[J].Biosystems and Bioproducts Engineering，2014（37）：1551-1559.

[12]CHEN Xiang，WANG Yaqing，SHAO Haiyan.Application of pure and mixed culture technologies for caproic acid bacteria[J].Liquor Making，2009，3（36）：35-36.（in Chinese）

[13]LIU Kun.Deterimination on the main components in Chinese liquor by gas chromatography[J].Hebei Chemical Industry，2012，35（3）：58-60.（in Chinese）

Improvement of Caproic Acid Production in the Mixed Culture of Clostridium kluyveri and Saccharomyces cerevisiae

JI Xiang1，2， XU Yan*1，2， MU Xiaoqing1，2， GE Xiangyang1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

In order to enhance the caproicacid productionof Clostridium kluyveri and shorten thefermentation period，this strain was co-colturedwith Saccharomyces cerevisiae and themechanism of enhancing caproic acid production in the mixed culture system was furtherly analyzed.Studies have revealed that：caproicacid yieldin the fermentation tank with pure colture of Clostridium kluyveri reached 6.35 g/L.However，caproic acid production with co-cultured system reached 7.09 g/L，which was 12.5%higher than that of the pure culture system and thetime reaching peak of caproic acid production was shortenedfor approximately 48 h.Relative data indicated that when co-culture wit Saccharomyces cerevisiae，thecaproic acid production of Clostridium kluyveriwas improved byincreasing the conversion rate of acetic acid to butyric acid.Analysis of dissolved oxygen values and microbial growth parameters indicated that the main reason for this change was that the growth of Saccharomyces cerevisiae improved the anaerobiclevel of co-culture system，whichpromoted the formation and transformation of butyric acid，hence the caproic acid production was enhanced.

Clostridium kluyveri，Saccharomycescerevisiae，purecolture co-culture，caproic acid

TS 261.1

A

1673—1689（2017）09—0922—05

2015-02-06

國家自然科學基金項目（31530055）。

*通信作者：徐 巖（1962—），男，浙江慈溪人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事釀造微生物學與工業酶學方面的研究。E-mail：yxu@jiangnan.edu.cn

嵇翔，徐巖，穆曉清，等.克氏梭菌和釀酒酵母混合培養提高己酸產量[J].食品與生物技術學報，2017，36（09）：922-926.