超氧化物歧化酶重組酵母的構建及其發酵條件的優化

張海玲， 劉 超， 程 欲， 孫金鈺， 鄭屹峰，傅 婷， 趙 丹， 劉樹滔*， 饒平凡

（1.福州大學 生物工程研究所，福建 福州 350002；2.中國科學院 上海生命科學研究院-浙江工商大學食品營養科學聯合研究中心，浙江 杭州 310035）

超氧化物歧化酶重組酵母的構建及其發酵條件的優化

張海玲1， 劉 超1， 程 欲1， 孫金鈺1， 鄭屹峰1，傅 婷1， 趙 丹1， 劉樹滔*1， 饒平凡2

（1.福州大學 生物工程研究所，福建 福州 350002；2.中國科學院 上海生命科學研究院-浙江工商大學食品營養科學聯合研究中心，浙江 杭州 310035）

超氧化物歧化酶（SOD）由于具有高效清除氧自由基的作用而廣泛用于食品、日化和醫藥領域。作者研究了提高SOD產量的基因工程新方法。利用密碼子優化后人源銅鋅超氧化物歧化酶基因，構建亞克隆及表達載體，最終轉化進巴斯德畢赤酵母進行表達。通過正交試驗，分析工程菌的最適搖瓶表達條件。搖瓶正交試驗確定最優表達條件為：28℃，誘導劑體積分數1.0%，接種體積分數1.0%，最優表達水平為2 339.4 U/mL，與現有的一些研究相比，其表達量提高了近3倍。這些結果表明：對人源銅鋅SOD經過適當的密碼子優化和發酵條件優化，使酵母表達量顯著提高，有助于解決SOD原料來源的局限。

人源銅鋅超氧化物歧化酶；基因工程；巴斯德畢赤酵母；表達；優化

自由基是含有一個或以上不成對電子的原子或原子團，極易奪取其他分子的電子而形成穩定的物質，當損傷性自由基的產生能力超過機體抗氧化防御系統的處理能力時，就稱為氧化應激[1]。人體中90%以上的自由基都是氧自由基，SOD可以將超氧陰離子自由基歧化為H2O2和O2，降低對機體的損害。

人體補充SOD可以預防或治療肌萎縮性側索硬化癥等自由基綜合癥[2]。SOD也可以作為保健食品的功能因子或食品營養強化劑，如添加了SOD的蛋黃醬、牛奶、啤酒和果汁飲料等；制成SOD食品或復合食品，如SOD膠囊、片劑和口服液等；以富含SOD的原料加工制成保健食品，如大蒜飲料、刺梨SOD汁等[3]。

國內外對SOD均有較大需求，目前SOD制備的研究主要有兩個方向，一是從動植物中提取，但往往會面臨原料來源和免疫原性兩個局限[4]；二是使用基因工程技術通過微生物表達人源SOD蛋白[5]。

作者嘗試將優化后的人源 Cu，Zn-SOD（hSOD1）基因轉化進巴斯德畢赤酵母中，獲取hSOD1的高表達工程菌和優化發酵條件，解決SOD的來源問題。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PCR和電穿孔儀：美國BIO-RAD公司；蛋白質電泳儀：日本ATTO公司；核酸電泳和轉膜電泳槽：北京六一儀器廠；pMD18-T simple：寶生物公司；pPICZαA表達質粒：Invitrogen公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母最適密碼子的優化 由于密碼子的簡并性，hSOD1的某些密碼子在酵母中成為稀有密碼子，影響蛋白合成的效率。從NCBI數據庫查得hSOD1基因后，參照畢赤酵母密碼子使用偏好性對密碼子進行替換，并兼顧GC含量在40%～60%之間，合成優化后的基因。

1.2.2 目的基因擴增 根據目的基因設計PCR引物，上游引物5'CTCGAGAAAAGAGCTACTAAGG CTG TTT 3'，下游引物5'TCTAGATTATTGGGCG ATACCGATAA 3'，其中下劃線部分分別為XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點、堿性氨基酸密碼子、終止密碼子。上游添加Lys和Arg兩個堿性氨基酸，利于蛋白質分泌表達時酵母細胞膜上的Kex2酶將前導肽和目的蛋白質切開。

PCR反應條件為：94℃預變性10 min；94℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，擴增 25 個循環；循環結束后72℃ 延伸10 min，4℃保存。

1.2.3 真核表達載體pPICZαA-SOD的構建 將膠回收的目的基因與pMD18-T simple連接，構建亞克隆載體后轉入大腸桿菌JM109，挑取陽性克隆子，經PCR和雙酶切初步驗證后測序。確認無突變后將亞克隆載體和pPICZαA表達質粒經XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切，分別回收hSOD1片段和pPICZαA載體片段，使用T4連接酶4℃過夜連接構建表達載體pPICZαA-SOD。將表達載體轉入大腸桿菌JM109中，涂布于氨芐抗性平板，挑取抗性菌進行培養，提取質粒雙酶切驗證后電轉化進畢赤酵母GS115，使用Zeocin抗性平板篩選重組菌，選取工程菌命名為GS115/pPICZαA-SOD。

1.2.4 目的蛋白質的誘導表達 挑取平板上的工程菌接種于5 mL YPD液體培養基中，30℃培養過夜后，接種體積分數1%至25 mL的YPD培養基。30℃搖瓶培養40 h，添加體積分數1.0%甲醇誘導，每隔24小時取樣并添加誘導劑，誘導4 d后收集發酵液，離心取上清液進行SDS-PAGE電泳和蛋白免疫印跡。

1.2.5 目的蛋白質表達條件的正交分析 設計3因素3水平的正交試驗，分析溫度、誘導劑和接種體積分數對最終蛋白質表達水平的影響[6]，以酶活為實驗指標，使用鹽酸羥胺法測定酶活。

2 結果與討論

2.1 目的基因PCR擴增結果

以密碼子優化后的基因為模板，使用設計的引物進行PCR擴增，獲得的目的基因片段長度為480 bp，電泳結果見圖1。

圖1 目的基因PCR擴增后電泳圖Fig.1 Electrophoresis spectrums of SOD gene expanded by PCR

2.2 鑒定真核表達載體pPICZαA-SOD

使用兩種限制性內切酶對pPICZαA-SOD載體進行雙酶切，電泳圖譜可見3.6 kb的載體片段和480 bp的目的片段，見圖2。

圖2 pPICZαA-SOD載體雙酶切驗證結果Fig.2 Restricion map of pPICZαA-SOD

2.3 目的蛋白質的誘導表達

搖瓶培養40 h以后開始誘導，圖3電泳結果表明，隨著誘導時間的增加，22 000附近的電泳條帶從無到有逐漸變深。純化后的樣品進行蛋白免疫印跡，也可在目標蛋白質處見特異條帶。

圖3 目的蛋白質誘導表達產物的SDS-PAGE和WB結果Fig.3 SDS-PAGE andWesternblottingresultof expression pruduct

2.4 表達條件的正交分析

設計正交試驗[7]，分析不同溫度、誘導劑量和接種體積分數對最終表達產物的影響，正交分析結果見表1。顯示1號試驗組酶活最高，可達2 339.4 U/mL，條件為溫度28℃、誘導劑體積分數1.0%、接種體積分數1.0%。

表1 SOD搖瓶表達條件的正交試驗分析Table 1 Orthogonal experiment of SOD’s expression condition in shaking culture

續表1

對試驗結果進行F檢驗，從表2的檢驗p值可以看出，溫度因素的檢驗p值為0.000 416，小于α=0.01，對試驗結果的影響極顯著，誘導量因素的檢驗p值為0.026 707，小于α=0.05，對試驗結果有顯著性影響，接種體積分數對試驗影響不顯著。

表2 正交試驗結果的F檢驗Table 2 F-test results of orthogonal experiment

3 結 語

巴斯德畢赤酵母表達系統因具有可分泌表達、背景蛋白質少、易于高密度發酵等優點，越來越廣泛地運用到科研和生產方面[8]。作者旨在構建出能高效分泌表達人源Cu，Zn-SOD的巴斯德畢赤酵母工程菌，利用畢赤酵母密碼子的偏好性來優化表達以提高產量。通過引物設計去掉前導肽和組氨酸標簽獲取天然構象蛋白質。

人源Cu，Zn-SOD已經在酵母系統中得到表達，但是表達水平往往不高，作者希望能通過上述技術提高酵母表達人源銅鋅SOD的產量。從正交試驗可以看出，本實驗構建的菌株在溫度28℃、誘導劑體積分數1.0%、接種體積分數1.0%的搖瓶條件下，表達的酶活可高達2 339.4 U/mL，遠遠高于國內現已發表文獻的表達水平，例如遲春萍等研究獲得的最高酶活性僅達到611 U/mL[9-10]，因此，本研究達到了實驗的預期。

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Construction and Expression of Recombinant Superoxide Dismutase in Pichia pastoris

ZHANG Hailing1， LIU Chao1， CHENG Yu1， SUN Jinyu1， ZHENG Yifeng1，FU Ting1， ZHAO Dan1， LIU Shutao*1， RAO Pingfan2

（1.Institute of Biotechnology，Fuzhou University，Fuzhou 350002，China；2.CAS.SIBS-Zhejiang Gongshang University Joint Centre for Food and Nutrition Research，Hangzhou 310035，China）

Superoxide dismutase （SOD） can be widely used in the field of food，cosmetic and medicine for its high capacity to scavenge free radicals.This paper reported a method of gene engineering attempting to solve the issue of SOD production.The gene of Cu，Zn-SOD with the yeast bias codon was firstly chemically synthesized and integrated into the genome of Pichia pastoris and the expression condition was optimized through orthogonal experiment.It was found that the maximum expression level of SOD was nearly three times greater than some reserach reported and the optimal temperature，methanol concentration and inoculation were 28 ℃ ，1.0%and 1.0%respectively.These results suggest that the problem of SOD production can be solved by improvingthe expression level of P.pastoris through the optimization of gene codon and fermentation conditions.

superoxide dimutase，gene engineering，Pichia pastoris，expression；optimization

Q 78

A

1673—1689（2017）09—0918—04

2015-04-17

國家自然科學基金項目（31071497，31271859）；國家973計劃項目（2010CB530605）；國家重點研發項目（2016YFD0400200）。

*通信作者：劉樹滔（1970—），男，福建周寧人，農學博士，教授，碩士研究生導師，生物化學與分子生物學專業。Email：stliu@fzu.edu.cn

張海玲，劉超，程欲，等.超氧化物歧化酶重組酵母的構建及其發酵條件的優化[J].食品與生物技術學報，2017，36（09）：918-921.