電離輻射對肺腺癌細胞A549早衰的影響*

李至薈 封江彬 李峰生 陸 雪 蔡恬靜 李 爽 趙 驊 田雪蕾 周丁華 劉青杰 高 玲*

電離輻射對肺腺癌細胞A549早衰的影響*

李至薈①封江彬②李峰生③陸 雪②蔡恬靜②李 爽②趙 驊②田雪蕾②周丁華③劉青杰②高 玲②*

目的：探究不同劑量X射線對肺腺癌細胞A549早衰的影響，為輻射誘導細胞早衰機制的探索提供理論依據。方法：采用不同劑量X射線照射肺腺癌細胞A549，按照X射線吸收劑量情況將實驗分為對照組和照射組，對照組X射線吸收劑量為0 Gy，照射組的X射線吸收劑量分別為2 Gy、4 Gy和8 Gy。利用克隆形成率實驗檢測細胞增殖能力變化，吉姆薩染色觀察細胞形態，利用溶酶體紅色熒光探針Lyso-Tracker Red檢測A549細胞的溶酶體數量變化，?-半乳糖苷酶染色檢測早衰細胞。結果：照射組吸收劑量為2 Gy、4 Gy和8 Gy的A549增殖能力降低，與對照組比較差異有統計學意義(F=186.45，P＜0.05)，且部分細胞體積變大，溶酶體數量增多，細胞出現早衰。結論：X射線可引起A549細胞增殖能力降低，溶酶體數量增加等細胞早衰癥狀。

X射線；肺腺癌細胞；早衰

早熟衰老或早衰是指細胞在非端粒信號刺激下發生增殖能力和生理功能下降，是細胞在生長、發育的過程中，形態和功能發生變化，提前出現退行性改變，這種形式的衰老與端粒縮短無關，也與細胞增殖代數無關，即病理性衰老。能夠誘導細胞早衰的刺激因素包括DNA受損、氧化應激和一些致癌基因的表達變化等[1-5]。早熟衰老的腫瘤細胞并不立即死亡，甚至可以在較長的時間內仍具有存活力，但卻失去了增殖與轉移的能力。按著這種特性實施的以細胞衰老為靶標的治療，雖然在縮小腫瘤體積方面的作用不強，但可通過帶瘤生存的方式顯著延長腫瘤患者的生存時間。因此，誘導腫瘤細胞的早衰是一個很有研究前景的新的腫瘤治療策略[6]。本研究探究不同劑量X射線對肺腺癌細胞A549早衰的影響，旨在為輻射誘導細胞早衰機制的探索提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

(1)Precise直線加速器(瑞典Elekta公司)。

(2)特級胎牛血清和高糖培養基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)。培養基購自美國GIBCO公司；D-Hank's緩沖液、甲醛溶液、姬姆薩染色液和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)均為本實驗室配制；溶酶體紅色熒光探針Lyso-Tracker Red試劑盒和?-半乳糖苷酶染色試劑盒購自上海碧云天公司；人肺腺癌細胞A549購自北京協和醫學院細胞庫。

1.2 細胞培養與分組

(1)細胞培養。細胞株采用含有10%滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養液培養。

(2)分組。按照X射線吸收劑量情況將實驗分為對照組和照射組，對照射組的X射線吸收劑量為0 Gy，照射組的X射線吸收劑量分別為2 Gy、4 Gy和8 Gy。

1.3 X射線照射

X射線照射使用Precise直線加速器產生的X射線單次照射細胞，源靶距為100 cm，能量為6 MV，照射組吸收劑量分別為2 Gy、4 Gy和8 Gy，采用電離室進行劑量校準。

1.4 克隆形成率實驗

常規消化指數生長期的細胞，用DMEM培養液懸成單細胞后置于10 ml離心管中，密封照射，兩組細胞分別接種后置于5 ml預溫37 ℃培養液的60 mm培養皿中，接種500個細胞。以十字方向輕輕晃動培養皿，使細胞分散均勻。將培養皿移入CO2培養箱，在溫度為37 ℃、CO2體積分數為5%和濕度為95%的環境下靜置培養7 d后終止培養。用預溫的D-Hank's緩沖液洗滌2遍后再用甲醇固定20 min，去甲醇，姬姆薩染色液染色15 min，沖洗晾干后解剖顯微鏡下計數克隆數，計算克隆形成率(colony forming efficiency，CFE)為公式1：

計算存活分數(survival fraction，SF)為公式2：

1.5 溶酶體紅色熒光探針Lyso-Tracker Red染色實驗

取少量Lyso-Tracker Red按照1∶20000的比例加入到細胞培養液中，使最終濃度為75 nmol/LnM。

使用前37 ℃預溫育。去除細胞培養液，加入1 ml配制好的并37 ℃預溫育的Lyso-Tracker Red染色工作液，與細胞37 ℃共孵育60 min。去除Lyso-Tracker Red染色工作液，加入新鮮的細胞培養液，用熒光顯微鏡進行觀察，可觀察到溶酶體呈明亮紅色熒光染色。

1.6 β-半乳糖苷酶染色實驗

將在6孔板中培養的細胞吸除細胞培養液，用PBS洗滌1次，加入1 mlβ-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。吸除細胞固定液，用PBS洗滌細胞3次，每次3 min。吸除PBS每孔加入1 ml染色工作液，于37 ℃孵育過夜，用保鮮膜封住6孔板防止蒸發。在普通光學顯微鏡下觀察拍攝。

1.7 統計學方法

應用SPSS 12.0統計軟件進行數據處理，數據符合正態分布，兩組比較采用獨立樣本，每個照射組均與對照組配對，照射組與對照組之間的比較采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同劑量X射線照射對細胞增殖的影響

不同劑量X射線照射后，細胞增殖能力均受到顯著抑制，照射組中吸收劑量為2 Gy時克隆形成率是對照組的67%，吸收4 Gy時細胞增殖能力降低50%，是對照組的49%，吸收8 Gy時克隆形成率僅是對照組的25%，兩組細胞增殖能力比較，其差異有統計學意義(F=186.45，P＜0.05)，見表1。

表1 克隆形成率檢測不同劑量X射線對A549細胞增殖的影響(%，x-±s)

2.2 不同劑量X射線照射對細胞形態的影響

經X射線照射后的A549細胞，利用姬姆薩染色液染色后在顯微鏡下觀察其細胞形態學改變，照射組吸收劑量為2 Gy、4 Gy和8 Gy的細胞形狀均變大、變平，并且隨著劑量的增大，其形態學變化越明顯， 如圖1所示。

圖1 兩組不同劑量X射線照射后A549細胞形狀變化(姆薩染色，×100)

2.3 不同劑量X射線照射對細胞溶酶體的影響

溶酶體數量的變化是早衰的另一個特征，因此，利用溶酶體紅色熒光探針Lyso-Tracker Red檢測照射后A549細胞的溶酶體數量變化，照射后細胞內溶酶體紅色熒光顯示，溶酶體數量增多，如圖2所示。

圖2 溶酶體紅色熒光探針檢測X射線照射A549細胞后細胞胞內溶酶體數量的改變(Lyso-Tracker Red染色，×100)

2.4 不同劑量X射線照射對細胞衰老的影響

利用?-半乳糖苷酶染色實驗檢測兩組經X射線照射后A549細胞中的早衰細胞比例。照射組吸收劑量分別為2 Gy、4 Gy和8 Gy；對照組為0 Gy，A549細胞中出現部分早衰細胞，但兩組間差異無統計學意義(如圖3所示)。

圖3 ?-半乳糖苷酶染色檢測不同劑量電離輻射照射A549細胞后早衰細胞(?-半乳糖苷酶染色，×100)

3 討論

在眾多的衰老假說中，衰老蛋白質學說研究的較為充分。本研究表明，體內存在著衰老基因和抗衰老基因兩類，相互作用調控細胞的衰老過程。多項研究表明，誘發細胞衰老的刺激信號主要有端粒脫帽、DNA損傷、氧化應激、癌基因過表達以及營養狀況不良等[7]。

電離輻射誘導的早衰取得了部分進展，有研究結果表明，電離輻射可誘導乳腺癌MCF-7細胞和人間充質干細胞等發生早衰[8]。Wang等[9]的研究表明，吸收劑量為8 Gy的γ射線可誘導骨髓基質細胞經由p53/p21通路誘導細胞早衰。Kim等[10]發現，在肝癌細胞HepG2中，輻射誘導的細胞早衰不依賴于p53/p21通路，而是由p16介導。2013-2014年陸續有課題報道，輻射可誘發包括肺癌細胞在內的各種細胞發生早熟衰老，但其研究僅限于揭示早衰現象及檢測下游早衰相關分子p53和p16等，而對其更上游的與放射損傷早期反應密切關聯的調節機制還有待更深入的研究闡述[11-15]。

本研究結果表明，不同劑量X射線可引起肺腺癌細胞A549發生不同程度的早衰，出現一系列早衰的癥狀，具體表現為細胞增殖能力顯著性降低，細胞形態變大變平，細胞內溶酶體數量增加，?-半乳糖苷酶染色為藍色陽性。對于X射線引起的肺腺癌細胞A549所發生的不同程度早衰需要開展進一步的研究，以闡明輻射引發的早衰上游信號通道。

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Effect of ionizing radiation on premature senility of human lung adenocarcinoma A549

LI Zhi-hui, FENG Jiang-bin, LI Feng-sheng, et al//
China Medical Equipment,2017,14(10):134-136.

Objective: To investigate the effect of different dosages X-ray for premature senility of lung adenocarcinoma cell line A549, and provide the theoretical basis for exploring the radiation-induced mechanism of premature senility. Methods: Different dosages X-ray were adopted to radiate lung adenocarcinoma A549 cells, and all of A549 cells were divided into control group and radiation group as the adsorbed dosage of X-ray. The adsorbed dosage of control group was 0 Gy, and the adsorbed dosages of three radiation groups were 2 Gy, 4 Gy and 8 Gy, respectively. The cloning efficiency experiment was used to detect the change of cell proliferative capacity,and giemsa staining was used to observe the change of cellular morphology, and lysosome red fluorescence probe(Lyso-Tracker Red) was used to detect the change of lysosome amount. Besides, β-galactosidase staining was used to detect cell of premature senility. Results: The proliferative capacities of A549 in all of radiation groups were decreased, and the differences of proliferative capacities between three radiation groups and control group were statistically significant (F=186.45, P＜0.05). Besides, in some cells of radiation groups, the volume of cell became larger, the amount of lysosome was increase and these cell appeared premature senility. Conclusion: X-ray can lead to some symptoms of cellular premature senility include the decrease of proliferative capacity of A549 cell and the increase of lysosome amount.

X-ray; Lung adenocarcinoma cell; Premature senility

Department of General Surgery, The Second Clinical Medical College of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China.

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.10.039

李至薈,男,(1990- ),碩士研究生，山西醫科大學第二臨床醫學院，研究方向：肝膽胰診療。

2017-06-29

1672-8270(2017)10-0134-03

R811.5

A

國家自然科學基金面上項目(31570852)“ STAT3調控caveolin-1介導的抗早衰在腫瘤輻射抗性中的作用及機制研究”

①山西醫科大學第二臨床醫學院 山西 太原 030001

②中國疾病預防控制中心輻射防護與核應急中國疾病預防控制中心重點實驗室 北京 100088

③火箭軍總醫院肝膽外科 北京 100088

*通訊作者：gaolingxinxin@126.com