沉默細胞周期檢測點激酶l基因對人膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響

姜明哲，李國忠

(天津市第五中心醫院，天津300450)

沉默細胞周期檢測點激酶l基因對人膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響

姜明哲，李國忠*

(天津市第五中心醫院，天津300450)

目的探討沉默細胞周期檢測點激酶l(Chk1)基因對人膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響。方法培養人膀胱癌T24細胞，根據轉染物的不同，將細胞分為siRNA-Chk1組、siRNA-對照序列組和空白對照組，利用實時熒光定量PCR檢測各組細胞中Chk1基因表達，MTT法檢測各組細胞增殖能力，利用流式細胞術檢測各組細胞凋亡，利用流式細胞術檢測各組細胞周期，利用Western blot法檢測各組細胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白表達。結果與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細胞中Chk1 mRNA相對表達量降低(F=43.813，P=0.000)；與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細胞24 h、48 h、72 h和96 h時吸光度A值均降低(P<0.05)；與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細胞凋亡率顯著增加(F=90.736，P=0.000)；流式細胞術檢測結果顯示，siRNA-Chk1組G0/G1期和S期高于siRNA-對照序列組和空白對照組，而G2/M期低于siRNA-對照序列組和空白對照組(P<0.05)；與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白相對表達量均降低(P<0.05)。結論特異性沉默Chk1基因可抑制人膀胱癌T24細胞增殖，加速細胞凋亡，其機制可能與抑制Chk1/Cdc25C/CyclinB1通路而減少細胞G2/M期阻滯有關。

膀胱癌；細胞周期檢測點激酶l；細胞增殖；細胞凋亡

細胞周期檢測點激酶1(checkpoint kinase 1，Chk1)作為高度保守的一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在維持正常的細胞周期及基因組穩定、調控細胞凋亡中具有重要作用[1]，有研究指出[2]，Chk1在多種惡性腫瘤中表達上調，與腫瘤發生及進展過程密切相關。本研究擬利用小干擾RNA(siRNA)技術特異性沉默人膀胱癌T24細胞中Chk1基因，從分子細胞學角度探討其對細胞增殖和凋亡的影響，以期為膀胱癌機制研究提供基礎資料。

1 資料與方法

1.1主要試劑和設備

人膀胱癌T24細胞購自中科院上海生物細胞研究所，RPMI-1640培養液、胎牛血清購自美國Gibco公司，0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自武漢博士德生物公司，Trizol總RNA提取試劑盒、Lipfectamine 2000脂質體轉染試劑盒購自美國Intrivigen公司，逆轉錄和PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，siRNA-Chk1和siRNA-對照序列均由上海吉瑪制藥技術公司設計合成，Chk1及內參引物均由上海生工生物公司設計合成，四甲基偶氮唑藍(MTT)細胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自廣州威佳科技有限公司，碘化丙啶(PI)染液購自美國Sigma公司，細胞周期檢測試劑盒購自上海研謹生物科技有限公司，兔抗Chk1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗Chk1介導的細胞分裂周期蛋白25C(Cdc25C)多克隆抗體購自美國Abzoom公司，兔抗人周期素B1(Cyclin B1)抗體購自上海萬疆生物技術公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，凝膠電泳成像分析系統購自美國Bio-rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養和分組處理 取人膀胱癌T24細胞，置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，于含5% CO2的37℃恒溫培養箱中培養。取對數生長期細胞，接種于6孔板中，繼續培養，待細胞融合度達80%左右時，利用Lipfectamine 2000脂質體轉染試劑盒對細胞進展轉染，根據轉染物的不同，對細胞進行分組：①siRNA-Chk1組：轉染Chk1基因的干擾序列：正義鏈：5’-CCGGCTGCAAATAGTAGTTCCTGA ACTCGAGTTCAGGAACTACTATTTGCAGTTTTTG-3’，反義鏈：5’-AATTCAAAAACTGCAAATAGTAGTTCCTGAACT-CGAGTTCAGGAACTACTATTT-GCAG-3’；②siRNA-對照序列組：轉染Chk1基因的對照序列：正義鏈：5’-GATCCCCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAG-3’，反義鏈：5’-AGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTGG-AAA-3’；③空白對照組：不作任何處理。轉染后繼續在含5% CO2的37℃恒溫培養箱中培養48 h，完成后續實驗。

1.2.2利用實時熒光定量PCR檢測各組細胞中Chk1基因表達 取各組轉染后培養48 h細胞，利用細胞裂解液裂解后，用總RNA提取試劑盒獲得細胞中總RNA，利用紫外分光光度計檢測總RNA純度，以A260/A280≥1.80作為合格樣品完成后續實驗。將總RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR。引物序列：Chk1引物：上游：5’-ATGCTCGCTGGAGAATTGC-3’，下游：5’-ATAAGGAAAGACCTGTGCGG-3’；GAPDH引物：5’-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游：5’-TGATTTTGGAGGGATGTCGC-3’。PCR反應條件：94℃ 1 min，92℃ 30 s，56℃ 30 s，74℃ 30 s，連續進行38次循環，每個樣品均設置6個平行反應復孔。用2-△△Ct法對各組細胞中Chk1基因相對表達量進行分析。

1.2.3MTT法檢測各組細胞增殖能力 取各組細胞，胰酶消化，加入到96孔板中，調整細胞密度為2×105個/孔，繼續于含5% CO2的37℃恒溫培養箱中培養。分別于培養12 h、24 h、48 h、72 h和96 h時，向各孔加入MTT液20 μl，繼續培養4 h，棄去上清，加入二甲基亞砜液150 μl，利用酶標儀于490 nm波長處檢測各孔吸光度A值，重復檢測6次，取均值。

1.2.4利用流式細胞術檢測各組細胞凋亡 取各組轉染后培養48 h細胞，胰酶消化，采用2 000×g離心力離心5 min，收集1×106個細胞，冷PBS沖洗3次，用1×結合緩沖液500 μl重新懸浮細胞，分別將Annexin V-FITC 5 μl和PI液5 μl加入各管，室溫下避光孵育15 min，于60 min內上機檢測，計數凋亡細胞比例，各組重復檢測6次，取均值。

1.2.5利用流式細胞術檢測各組細胞周期 取各組轉染后培養48 h細胞，胰酶消化，采用2 000×g離心力離心5 min，收集1×106個細胞，用PBS緩沖液沖洗3次，于4℃下用70%無水乙醇過夜固定。離心后棄去上清，加入PBS靜置20 min，離心后棄去上清，將核糖核酸酶5 μl加入，37℃靜置60 min，將50 μl的PI加入，室溫下避光染色25 min，利用流式細胞儀對細胞周期進行檢測。

1.2.6利用Western blot法檢測各組細胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白表達 取各組轉染后培養48 h細胞，利用細胞裂解液裂解后，提取總蛋白，用BCA法檢測蛋白純度并定量。取50 μg總蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉進行封閉120 min，加入一抗兔抗Chk1多克隆抗體、兔抗Cdc25C多克隆抗體和兔抗人Cyclin B1抗體(稀釋比例：1∶1 200、1∶800、1∶1 000)，4℃條件下過夜孵育，用TBST漂洗3次，將二抗加入，室溫下孵育60 min，用TBST漂洗3次，加入化學發光試劑盒進行避光顯色，拍照。用Image J圖像分析軟件對條帶進行分析，獲得各組細胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白相對表達量。

1.3統計學分析

2 結果

2.1各組細胞中Chk1基因表達

siRNA-Chk1組、siRNA-對照序列組和空白對照組細胞中Chk1 mRNA相對表達量分別為(1.22±0.20)、(2.10±0.13)和(2.14±0.23)，與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細胞中Chk1 mRNA相對表達量降低，差異有統計學意義(F=43.813，P=0.000)。

2.2各組細胞增殖能力比較

MTT實驗結果顯示，與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細胞24 h、48 h、72 h和96 h時吸光度A值均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.3各組細胞凋亡率比較

siRNA-Chk1組、siRNA-對照序列組和空白對照組細胞凋亡率分別為(15.2±2.5)%、(2.8±1.8)%和(2.5±0.9)%，與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細胞凋亡率顯著增加，差異有統計學意義(F=90.736，P=0.000)，見圖2。

圖1 不同時點各組細胞增殖能力比較

圖2 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況(A：siRNA-Chk1組、siRNA-對照序列組和空白對照組)

2.4各組細胞周期比較

流式細胞術檢測結果顯示，siRNA-Chk1組G0/G1期和S期高于siRNA-對照序列組和空白對照組，而G2/M期低于siRNA-對照序列組和空白對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組細胞周期比例比較

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與siRNA-對照序列組比較，bP<0.05

2.5各組細胞中Chk1、Cdc25C和CyclinB1蛋白表達比較

與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白相對表達量均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2和圖3。

表2 各組細胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白表達比較

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與siRNA-對照序列組比較，bP<0.05

圖3 各組細胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白表達

3 討論

膀胱癌作為預后較差的泌尿系統腫瘤，病因和發病機制較為復雜，有研究指出[3]，膀胱癌細胞較強的增殖能力是導致患者轉移和復發的重要因素。Chk1位于人類11q24染色體，由13個外顯子組成，作為細胞周期檢測點中的主要蛋白，在調節細胞周期中發揮重要作用，是DNA損傷修復及保證基因完整性的關鍵基因[4]。正常生理狀態下，Chk1可將細胞阻滯在G2/M期檢測點，進行包括周期阻滯、錯配修復、周期恢復等一系列的級聯反應，使細胞基因完整及周期保持穩定[5]。而細胞增殖及凋亡平衡打破，本應停止增殖或發生凋亡的細胞仍進入細胞周期無限制增殖是導致腫瘤發生的根本原因[6]。研究表明[7]，Chk1低表達于正常細胞，但卻高表達于多種惡性腫瘤組織中，參與了惡性腫瘤發生及進展過程。本研究利用siRNA技術特異性沉默人膀胱癌T24細胞中Chk1基因，熒光定量PCR和Western blot檢測結果均顯示，siRNA-Chk1組細胞中Chk1基因和蛋白相對表達量均降低，提示人膀胱癌T24細胞中Chk1基因被成功沉默。

MTT實驗結果顯示，與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細胞24 h、48 h、72 h和96 h時吸光度A值均降低，提示siRNA-Chk1組細胞增殖能力降低，說明特異性沉默Chk1基因可有效降低人膀胱癌T24細胞增殖能力。本研究顯示，與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細胞凋亡率顯著增加，說明特異性沉默Chk1基因可有效增加人膀胱癌T24細胞凋亡水平，進一步對細胞周期進行分析發現，siRNA-Chk1組G0/G1期和S期高于siRNA-對照序列組和空白對照組，而G2/M期低于siRNA-對照序列組和空白對照組，說明特異性沉默Chk1基因可減弱人膀胱癌T24細胞G2/M期阻滯，使G2/M期細胞比例降低，有研究指出[8]，Chk1基因高表達可使腫瘤細胞停留在G2/M期，從而有利于細胞的自我修復，加速細胞增殖。而特異性沉默Chk1基因可阻滯這一過程。研究表明[9]，Chk1/Cdc25C/CyclinB1是調控細胞G2/M期阻滯的主要通路。有研究指出[10]，MMEQ可上調Chk1及Cdc25c基因表達，從而誘導膀胱癌TSGH8301細胞阻滯在G2/M期。本研究結果顯示，與空白對照組和siRNA-對照序列組比較，siRNA-Chk1組細胞中Chk1、Cdc25C和Cyclin B1蛋白相對表達量均降低，說明特異性沉默Chk1基因可能通過抑制Chk1/Cdc25C/CyclinB1通路而減少人膀胱癌T24細胞G2/M期阻滯。

綜上所述，特異性沉默Chk1基因可抑制人膀胱癌T24細胞增殖，加速細胞凋亡，其機制可能與抑制Chk1/Cdc25C/CyclinB1通路而減少細胞G2/M期阻滯有關。

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R737.14

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2016-11-19)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1834-04