維生素A缺乏干眼病角膜組織上皮細胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表達與細胞凋亡的關系研究

叢 越，王萬梅

(吉林大學第二醫院，1.眼底病科；2.心血管內科，吉林 長春130041)

維生素A缺乏干眼病角膜組織上皮細胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表達與細胞凋亡的關系研究

叢 越1，王萬梅2

(吉林大學第二醫院，1.眼底病科；2.心血管內科，吉林 長春130041)

目的探究維生素A缺乏干眼病角膜組織上皮細胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表達與細胞凋亡的關系，為干眼病發病機制的研究提供理論依據。方法5只雄兔維生素A缺乏干眼病模型以及5只正常喂養的雄兔，分別設為觀察組與對照組。采用原位末端標記及免疫組織化學方法檢測兩組試驗動物角膜組織上皮細胞的細胞凋亡情況，并檢測FasL、Fas、Bax以及bcl-2等相關基因蛋白在角膜上皮細胞中的表達，探討維生素A缺乏干眼病角膜組織上皮細胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表達與細胞凋亡的關系。結果觀察組雄兔每高倍鏡視野角膜組織上皮細胞凋亡數量為(4.89±1.34)個，對照組為(0.65±0.32)個，差異具有統計學意義(P<0.05)；觀察組每1000個角膜組織上皮細胞Fas、FasL、Bax陽性表達細胞數量分別為(187.35±23.23)、(212.45±24.55)、(168.67±21.43)個，顯著高于對照組(65.23±18.23)、(68.46±14.51)、(48.43±16.46)個，觀察組每1000個角膜組織上皮細胞bcl-2陽性表達細胞數量為(54.44±16.34)個，顯著低于對照組(217.43±24.13)個，差異有統計學意義(P<0.05)；Fas、FasL、Bax的表達與角膜組織上皮細胞凋亡呈顯著正相關(r=0.675，r=0.785，r=0.678，P=0.000)，bcl-2的表達與角膜組織上皮細胞凋亡呈顯著負相關(r=-0.754P=0.000)。結論角膜組織上皮細胞凋亡可能導致角膜組織上皮細胞出現干燥、變薄，引起功能減退，導致干眼病癥狀，這可能與Fas、FasL、Bax表達量增多，bcl-2的表達量降低加快角膜組織上皮細胞凋亡有關。

維生素A缺乏干眼?。唤悄そM織上皮細胞；Fas；FasL；Bax；bcl-2；表達；細胞凋亡

(ChinJLabDiagn,2017,21:1820)

干眼病是指各種因素引起的淚液動力學、質或量異常，導致降低淚膜穩定性，并伴有眼表組織病變以及眼部不適等特征的多種疾病的總稱，臨床上又命名為角結膜干燥癥。常見癥狀有疲倦、干澀、異物感、眼癢、痛灼熱感、怕風、分泌物黏稠、畏光、外界刺激敏感等；眼睛干澀，基本淚液不足，出現反射性淚液分泌引起經常流淚，嚴重者出現眼睛紅腫、充血、角質化等，部分可引起角結膜病變，視力受損[1]。傳統理論認為上皮完整性受損、壞死脫落是干眼病角膜特征性病理變化。近年國外有報道[2]認為，干眼病患者角膜上皮細胞有向小細胞轉化的趨勢，病情嚴重者角膜上皮甚至呈角膜上皮結膜化或鱗狀化，而角膜上皮修復及愈合過程能夠觀察到細胞凋亡的存在，Fas、FasL、Bax和bcl-2等基因的表達與細胞凋亡具有明顯的關系。因此本實驗通過建立維生素A缺乏的雄兔干眼病模型，探究維生素A缺乏干眼病角膜組織上皮細胞Fas、FasL、Bax和bcl-2的表達與細胞凋亡的關系，為干眼病的發病機制的研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料

5只雄兔維生素A缺乏干眼病模型，以及5只正常喂養的雄兔，分別設為觀察組與對照組。觀察組日齡90 d；體重最輕2.45 kg，最重2.57 kg，平均(2.51±0.04)kg；對照組日齡90 d；體重最輕2.49 kg，最重2.65 kg，平均(2.52±0.05)kg；實驗兔均為雄性新西蘭白兔，由我院動物中心飼養，兩組基礎飼養完全相同。比較兩組日齡，體重等一般資料無顯著性差異(P>0.05),具有可比性。

1.2模型建立及標本處理

模型建立：兩組基礎飼養完全相同，觀察組雄兔給予完全缺乏維生素A的飼料，對照組正常飼料，每日維生素A攝入量不低于200 μg/kg。所有動物均由一名工作人員檢查，每次檢查地點、時間、光照、濕度及溫度均保持相同。分別飼養90 d后，觀察組毛發較粗糙，角膜無光澤、干燥，有灰白色潰瘍灶出現。淚液分泌(schirmer)實驗顯示觀察組均<10 mm/5 min，對照組均>20 mm/5 min。觀察組淚膜破裂時間均<12 s，對照組均>24 s，根據文獻[3]干眼病的診斷標準確定模型建立成功。標本處理：飼養90 d后兩組試驗兔均采用空氣栓塞法處死，死后立刻取雙眼角膜組織且攜帶1 mm的鞏膜環，采用40 g/L的多聚甲醛固定，采用常規石蠟包埋、HE染色。

1.3方法

采用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的脫氧三磷酸尿苷缺口末端標記法(TUNEL)檢測原位細胞凋亡情況，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(FITC)購自上海翊圣生物科技有限公司；山羊抗兔Fas、FasL、Bax和bcl-2多抗購自北京索萊寶科技有限公司；過氧化物酶標記鏈酶白卵素(SABC)免疫組織化學試劑盒購自美國R&D公司；3，3’-二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑購自上海安妍生物有限公司。標本切片后嚴格參照試劑盒說明書進行染色，凋亡細胞原位檢測陽性對照在滴加反應液前，于1 g/LDNase I溶液進行15 min的室溫孵育；陰性對照組僅添加dUTP-FITC。采用乳腺癌石蠟切片處理免疫組織化學染色陽性對照，采用PBS液代替一抗處理陰性對照。細胞凋亡數統計：隨機選取兩組5-7個400倍的高倍視野中凋亡細胞總數，計算平均值；Fas、FasL、Bax和bcl-2的表達：隨機選取1 000個角膜上皮細胞，觀察免疫組織化學染色陽性細胞總數。

1.4統計學分析

2 結果

2.1兩組角膜組織上皮細胞凋亡數量比較

觀察組雄兔每高倍鏡視野角膜組織上皮細胞凋亡數量為(4.89±1.34)個，對照組雄兔為(0.65±0.32)個，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組角膜組織上皮細胞凋亡數量比較

2.2兩組角膜組織上皮細胞Fas、FasL、Bax、bcl-2陽性表達細胞數量比較

觀察組每1000個角膜組織上皮細胞Fas、FasL、Bax陽性表達細胞數量分別為(187.35±23.23)、(212.45±24.55)、(168.67±21.43)個，顯著高于對照組(65.23±18.23)、(68.46±14.51)、(48.43±16.46)個，觀察組每1000個角膜組織上皮細胞bcl-2陽性表達細胞數量為(54.44±16.34)個，顯著低于對照組(217.43±24.13)個，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組每1000個角膜組織上皮細胞Fas、FasL、Bax、bcl-2陽性表達細胞數量比較

2.3Fas、FasL、Bax、bcl-2的表達與角膜組織上皮細胞凋亡的相關性

Fas、FasL、Bax的表達與角膜組織上皮細胞凋亡呈顯著正相關(r=0.675，r=0.785，r=0.678，P=0.000)，bcl-2的表達與角膜組織上皮細胞凋亡呈顯著負相關(r=-0.754P=0.000)，見表3。

表3 Fas、FasL、Bax、bcl-2的表達與角膜組織上皮細胞凋亡的相關性

3 討論

臨床上認為導致干眼病主要有以下原因：(1)長期戴隱形眼鏡、自身免疫疾病引起的淚腺發炎、眼外傷、自律神經失調、眼部感染、先天性無淚腺以及長期使用眼藥水導致的淚液分泌不足造成的水液層淚腺淚液分泌不足[4]；(2)因眼瞼疾病引發的瞼板腺功能不良出現油脂層分泌降低[5]；(3)慢性結膜炎、缺乏維生素A、化學性灼傷等造成的粘蛋白層分泌降低；(4)因疾病引起的眨眼次數少、眼瞼閉合不良、長時間停留戶外等導致淚液過度蒸發出現淚膜分布不均勻[6]。本實驗以不給予維生素A進行干眼病家兔模型的建立，維生素A缺乏可直接引起淚腺腺體萎縮、結膜與角膜上皮干燥而造成干眼病癥狀[7]。本研究觀察組雄兔每高倍鏡視野角膜組織上皮細胞凋亡數量顯著高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，證明角膜細胞凋亡可能作為重要原因影響干眼癥的發生及發展。

Fas是神經生長因子以及腫瘤壞死因子受體系統家族的一員，有報道[8]證實無論是Fas表達于細胞表面的，還是純化的FasL，只要能夠結合細胞表面的Fas分子，使后者出現交聯情況，能夠將信號傳遞到細胞內，細胞便能發生凋亡[9]。本研究結果表明，干眼癥兔角膜上皮細胞Fas蛋白的陽性表達細胞數較對照組明顯要高，相關性分析結果顯示與角膜組織上皮細胞凋亡呈正相關，表明干眼病患者角膜組織上皮細胞的凋亡過程可能有Fas參與介導。FasL、Bax的作用與Fas具有相似之處，其表達量增加也能促進細胞凋亡[10]，本研究結果顯示Fas、FasL、Bax的表達與角膜組織上皮細胞凋亡呈顯著正相關(r=0.675，r=0.785，r=0.678，P=0.000)，證實角膜組織上皮細胞凋亡與Fas、FasL、Bax的高表達有明顯的相關性。bcl-2主要在B淋巴瘤中分離得到，對細胞凋亡具有明顯的抑制作用，因此我們認為正常細胞中bcl-2基因均處于較高表達的狀態，而在凋亡細胞中其表達量可能降低，減弱了細胞凋亡的抑制作用，細胞凋亡加速[11,12]。本研究結果顯示觀察組每1000個角膜組織上皮細胞bcl-2陽性表達細胞數量顯著低于對照組，相關性分析結果顯示bcl-2的表達與角膜組織上皮細胞凋亡呈顯著負相關，這也能有力證明bcl-2基因表達降低細胞凋亡加快的理論[13]。

雖然目前尚未完全對干眼病的發病機理進行確切的判定，但認為其與角膜上皮細胞的細胞凋亡有明顯的關系。細胞凋亡參與干眼癥發病機制可能有以下兩個原因：(1)細胞凋亡導致淚腺和結膜杯狀細胞受到影響，引起角膜上皮結膜化或鱗狀化[14]；(2)細胞凋亡對炎癥細胞及淋巴細胞的影響，炎癥細胞分泌細胞因子對淚液分泌反射的正常神經聯系產生影響，進而使淚腺的神經支配降低，使淚腺腺泡的萎縮加重[15]。

綜上所述，角膜組織上皮細胞凋亡可能導致角膜組織上皮細胞出現干燥、變薄，引起功能減退，導致干眼病癥狀，這可能與Fas、FasL、Bax表達量增多，bcl-2的表達量降低加快角膜組織上皮細胞凋亡有關。

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RelationshipbetweenFas,FasL,Baxandbcl-2expressionindryeyecornealepithelialcellsinducedbyvitaminAdeficiencyandapoptosis

CONGYue,WANGWan-mei.

(TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of Fas,FasL,Bax and Bcl-2 in dry eye corneal epithelial cells induced by vitamin A deficiency and apoptosis,and to provide the theoretical basis for the study of the pathogenesis of dry eye.MethodsThe experimental subjects were 5 male rabbits model with dry eye induced by vitamin A deficiency,and 5 normal feeding male rabbits,rabbits were respectively set as the observation group and the control group.The corneal epithelial cells apoptosis was surveyed by in situ end-labeling (ISEL) and immunohistochemistry method,followed by FasL,Fas,Bax,bcl-2 and other related gene protein expression in corneal epithelial cells to primarily explore the relationship between Fas,FasL,Bax and bcl-2 expression in dry eye corneal epithelial cells induced by vitamin A deficiency and apoptosis.ResultsThe corneal epithelial cells count of the observation group per high-power field of view was (4.89±1.34),while the control group was (0.65±0.32),the difference had statistical significance (P<0.05);The observation group’s Fas,FasL,Bax positive cells expression number per 1000 corneal epithelial cell were (187.35±23.23),(212.45±24.55),(168.67±21.43),which was sharply higher than those of the control group (65.23±18.23),(68.46±14.51),(48.43 ±16.46).The observation group’s Bcl-2 positive cells expression amount per 1000 corneal epithelial cells was (54.44±16.34),which was evidently lower than that of the control group (217.43±24.13) ,the difference showed statistical meaning (P<0.05);A positive correlation was found between Fas,FasL,Bax expression and apoptosis of corneal epithelial cells(r=0.675,r=0.785,r=0.678,P=0.000),bcl-2 expression was negatively related to the apoptosis of corneal epithelial cells(r=-0.754,P=0.000).ConclusionThe apoptosis of corneal tissue epithelial cells may lead to dry,thinning,hypofunction,dry eye symptoms,which may be related to the increase of Fas,FasL,Bax expression and corneal tissue epithelial cells apoptosis acceleration caused by bcl-2 expression decrease.

dry eye induced by vitamin A deficiency;corneal epithelial cells;Fas;FasL;Bax;Bcl-2;expression;apoptosis

R772.2

A

2016-12-30)

1007-4287(2017)10-1820-04