Ghrelin對心梗后心衰大鼠心功能的影響及機制研究

楊春艷,馮朝暉,楊 萍,任 平

(1.吉林大學中日聯誼醫院 心內科,吉林 長春130033;2.吉林大學第一醫院 胸外科)

Ghrelin對心梗后心衰大鼠心功能的影響及機制研究

楊春艷1,馮朝暉1,楊 萍1,任 平2*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 心內科,吉林 長春130033;2.吉林大學第一醫院 胸外科)

目的闡明Ghrelin對心梗后心衰大鼠心功能的影響及其相關機制。方法采用結扎左冠狀動脈前降支構建心梗后心衰大鼠模型，并在術后將動物隨機分為模型組和Ghrelin治療組 ，并設立假手術組對照。術后第5周開始皮下注射Ghrelin，連續給藥4周。通過血流動力學檢測及心臟超聲檢查評價心功能，HE染色觀察心肌重構，TUNEL染色觀察心肌細胞凋亡情況，并應用ELISA檢測血管緊張素II(Ang II)水平。結果與假手術組相比，模型組大鼠的左室舒張末壓(LVEDP)明顯增加，左室收縮末壓(LVSP)與射血分數(EF)明顯下降；心肌細胞凋亡數明顯增加，心肌重構顯著；Ang Ⅱ水平明顯增高。與模型組相比，Ghrelin治療組LVSP 及EF顯著提高，LVEDP顯著降低；心肌細胞凋亡數目明顯減少，心肌重構減輕；Ang Ⅱ水平明顯下降。結論Ghrelin可抑制心肌細胞凋亡改善心肌重構，進而提高心衰大鼠心功能，其機制可能與Ghrelin下調Ang II抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)的激活有關。

心力衰竭;Ghrelin;血管緊張素Ⅱ;心肌細胞凋亡

(ChinJLabDiagn,2017,21:1812)

各種心血管疾病進展的最終歸宿是慢性心力衰竭(CHF)，其發病率高，是心血管疾病患者致殘及死亡的重要原因，已成為我國及其他國家主要的公共衛生問題[1,2]。促生長激素釋放多肽(Ghrelin)是生長激素促分泌素(GHS)受體的內源性配體，具有多種生物學活性，包括刺激生長激素(GH)分泌、調節代謝、促進攝食與肥胖等[3]。在心血管方面，已有研究表明Ghrelin可以增加心肌收縮力、舒張血管及保護心梗后心衰的形成等作用[4-8]。且有研究進一步表明Ghrelin及其受體GHSR-1a可在心臟表達[9]，并與心臟上的結合位點具有高度親合力[10-12]，此研究提示Ghrelin的心血管保護作用可不依賴于GH而獨立存在，但其具體的細胞與分子機制尚未完全闡明。本研究旨在探討Ghrelin對心梗后心衰大鼠心功能的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1動物本研究應用的是由吉林大學基礎醫學院動物實驗中心提供的體重200-220 g的雌性Wistar大鼠，合格證號：SCXK-(吉)2003-0001。

1.2主要試劑酰基化Ghrelin購自于中肽生物科技有限公司，Ang II ELISA檢測試劑盒購自上海朗頓生物技術有限公司，HE染色試劑盒購自碧云天生物技術公司，TUNEL檢測試劑盒購自羅氏公司(South San Francisco,California,USA)。

1.3大鼠心衰模型制備及分組大鼠適應性飼養1周后，隨機分為模型組和假手術組，模型動物行左冠狀動脈前降支結扎術，方法如下：乙醚吸入麻醉，備皮，局部消毒，先用10號縫線在開胸部位做一荷包，迅速開胸暴露心臟，模型組用0號線結扎左冠狀動脈前降支，假手術組僅穿線不結扎。術后迅速收攏荷包關閉胸腔，手術部位涂敷0.2%呋喃西林軟膏，并常規給予腹腔注射青霉素(20萬U/kg)7天。術后4周模型組存活大鼠20只，隨機分為模型組(MI 組：皮下注射與Ghrelin等體積的0.9%生理鹽水，2次/日)；模型-Ghrelin組(MI-Ghrelin 組：皮下注射Ghrelin 0.2 mg/kg，2次/日)。并設有假手術組(SO 組：皮下注射與Ghrelin等體積的0.9%生理鹽水，2次/日)。所有實驗大鼠藥物干預4周后終止飼養進行實驗。

1.4心臟超聲檢測給藥結束后，乙醚吸入麻醉后于左胸上至鎖骨下至肋骨下緣處備皮，對大鼠射血分數(EF)進行檢測。

1.5血流動力學檢測超聲檢測結束后，進行有創血流動力學檢測，方法簡述如下：經右側頸總動脈逆行插入左心室，待穩定后通過RM-6000型八通道生理記錄儀記錄左心室收縮末壓(LVSP)，左心室舒張期末壓(LVEDP)以及左室內壓最大上升/下降速率(±dp/dt max)。

1.6HE染色切取非梗死區心室肌組織約2 mm厚，用4%多聚甲醛固定72 h，之后常規石蠟包埋，切片(5 μm厚)，二甲苯脫蠟，下行梯度酒精水化，按試劑盒說明書進行蘇木素及伊紅染色，于顯微鏡下觀察染色程度。待染色結束后，上行梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察并拍照。

1.7心肌細胞凋亡檢測應用原位末端標記檢測法(TUNEL)進行檢測，具體步驟按TUNEL說明書進行。染色結束后于暗室光鏡下觀察，細胞核呈綠色熒光即為TUNEL陽性細胞。

1.8AngII水平檢測按照試劑盒操作說明檢測外周血及心肌組織Ang II水平， 測定450 nm波長光吸收值，根據標準曲線計算Ang II含量。

2 結果

2.1心功能相關指標檢測

血流動力學相關指標檢測結果：MI組大鼠LVEDP較SO組明顯增高，有顯著性差異(P<0.01)；LVSP及±dp/dt max(mmHg/s)均較SO組明顯降低，均有顯著性差異(P<0.01)；MI-Ghrelin組大鼠LVEDP較MI組明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)；LVSP及±dp/dt max(mmHg/s) 較MI組均明顯升高，均有顯著性差異(P<0.05)；MI組大鼠EF值較SO組明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)；MI-Ghrelin組大鼠EF較MI組明顯增加，有顯著性差異(P<0.01)。見表1。上述結果提示：Ghrelin可明顯改善心梗后心衰大鼠心功能。

表1 大鼠血流動力學檢測

**P<0.01 vs.SO group;#P<0.05,##P<0.01 vs.MI group.

2.2心肌組織形態學檢查

心肌組織HE染色結果觀察如下：SO組心肌纖維排列整齊，結構清晰；MI組心肌纖維部分斷裂，形態不規則，排列紊亂，大量纖維組織增生。MI-Ghrelin組與SO組比較，心肌細胞排列稍紊亂，有炎細胞浸潤及纖維組織增生；MI-Ghrelin組與MI組比較，斷裂心肌纖維減少，排列較整齊，炎細胞浸潤及纖維增生程度明顯減輕。見圖1。

2.3心肌組織細胞凋亡水平檢測

為明確Ghrelin改善心梗后心衰大鼠心功能的機制，應用TUNEL染色檢測各組大鼠心肌組織細胞凋亡水平。結果發現：MI組大鼠心肌組織細胞凋亡率較SO組明顯增加，有顯著性差異(P<0.01)；給予Ghrelin干預后，心衰大鼠心肌組織細胞凋亡率較未干預組明顯降低，有顯著性差異(P<0.01)。見圖2和3。上述結果提示：心肌細胞凋亡是心衰進展的重要因素，Ghrelin可能通過抑制心梗后心衰進程中的心肌細胞凋亡，進而改善心梗后心功能。

圖1 HE染色法檢測大鼠心肌組織病理學改變(×200)

圖2 TUNEL染色法檢測大鼠心肌組織細胞凋亡(×200)

**P<0.01 vs.SO group;##P<0.01 vs.MI group.

2.4外周血及心肌組織AngII水平檢測

為進一步探討Ghrelin抑制心肌細胞凋亡改善心肌重構的機制，研究還檢測了各組大鼠外周血與心肌組織Ang II水平。結果發現：與假手術組相比，模型組大鼠血漿及心肌組織AngⅡ 顯著上升(P<0.01)；而給予Ghrelin治療后AngⅡ表達明顯下降(P<0.01)。提示：Ghrelin可能通過下調Ang II表達抑制RAAS激活，進而抑制心肌細胞凋亡，改善心功能。

3 討論

雖然新型藥物和PCI等先進技術的不斷出現明顯降低了急性心肌梗死的死亡率，但卻使心梗后心力衰竭的發生率逐年上升，流病學研究顯示目前全球心衰患者的人數高達2250萬人，并仍以每年200萬的速度遞增，且5年存活率與惡性腫瘤相似[13]。盡管人們對心衰的治療進行了各種嘗試，但目前尚無逆轉心肌重構的有效手段。

表2 大鼠外周血及心肌組織Ang II水平

**P<0.01 vs.SO group;##P<0.01 vs.MI group.

心力衰竭的顯著特征之一是左心室收縮功能的進行性減退，而導致左室功能衰退的重要因素之一是心肌細胞數目減少，心肌細胞數目減少的直接因素為心肌細胞凋亡。以往的研究表明，成年心肌細胞凋亡存在于人類和其他哺乳動物的心肌組織[14]，且成年心肌細胞自我更新的能力非常有限[15]，因此，很少數量的成年心肌細胞凋亡即可對心功能造成持久的不良影響。本研究發現心衰大鼠心肌組織細胞凋亡率較假手術組明顯增加，這可能是模型組大鼠出現心衰的直接原因，與前人的研究結果相符，進一步證實心肌細胞凋亡是心力衰竭發生發展的重要因素之一。更重要的是研究發現給予外源性酰基化Ghrelin干預后，心衰大鼠的心功能明顯改善，心肌細胞凋亡數明顯減少，提示Ghrelin可通過抑制心肌細胞凋亡改善心功能。然而，心衰時心肌細胞凋亡的原因及誘因，以及Ghrelin抑制心衰心肌細胞凋亡的可能機制仍需進一步探討。

現已明確神經內分泌及細胞因子激活的一系列分子活動導致心室重構的組織學改變是心力衰竭發生發展的實質，而腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)的激活是神經內分泌激活的關鍵，其在心力衰竭發生發展中起核心作用[16]。RAAS的持續激活，可促進心肌纖維化、誘導心肌細胞凋亡、導致心肌肥厚、進而引起心室重構，加速心衰進展；而心衰進展又可進一步促進RAAS系統激活，形成惡性循環。RASS的核心分子是Ang II，心衰時由于有效循環血容量減少等因素可促使循環及心肌組織Ang II表達均增加。循環及心肌組織Ang II表達增加，在短期內可通過收縮血管增加血壓、促進鈉水潴留調節血容量等代償方式保護心功能；長期持續的增高則將通過升高血壓增加心臟負荷、促進心肌細胞肥大、促進心肌纖維化以及膠原合成、誘導心肌細胞凋亡等導致心肌重構，促進心衰進展[17-19]。因此，本研究為進一步探討Ghrelin改善心梗后心衰的機制，應用ELISA法檢測外周血及心肌組織Ang II表達，明確Ghrelin對循環及組織Ang II的影響，結果發現Ghrelin可明顯下調心衰大鼠循環及組織Ang II表達。提示：Ghrelin可能通過下調Ang II表達拮抗RAAS系統發揮保護心梗后心衰作用。

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EffectandMechanismofGhrelinonHeartFailureafterMyocardialInfarctioninRats

YANGChun-yan,FENGZhao-hui,YANGPing,etal.

(Departmentofcardiology,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo clarify the effect and possible mechanism of ghrelin on heart failure (HF) after myocardial infarction (MI)．MethodsThe rat model of heart failure was induced by ligating the left anterior descending (LAD) of female Wistar rats ,and the animals were randomly divided into the model group (MI) and the ghrelin treatment (MI-Ghrelin) group after the operation,and the sham operation (SO) group was compared.In the 5th week of surgery,ghrelin administered by subcutaneous injection for 4 weeks.Then,the cardiac function was assessed by LV end-diastolic pressure (LVEDP),left ventricular systolic pressure (LVSP),± dp/dt max (mmHg/s) and ejection fraction (EF%).Hematoxylin and eosin (H&E) staining waw used to analyze the morphological changes in the myocardium and TUNEL assay was performed to detecte myocardial apoptosis.In addition,the serum and non-infarct myocardial tissue angiotensin II (Ang II) were measured using ELISA.ResultsCompared with the sham group，the number of myocardial apoptosis,the LVEDP and of model group increased significantly(P<0.05 ),the LVSP,EF and the level of Ang II were decreased significantly(P<0.05).However,ghrelin could significantly increase the EF and LVSP,decrease the LVEDP,reduce the number of cardiomyocyte apoptosis,and down-regulated the expression of Ang II.ConclusionBy down-regulating the Ang II expression in myocardial cells in rat HF after MI,ghrelin treatment decreased the apoptosis of myocardial cells,suggesting the possible mechanism by which ghrelin functions in protecting against heart failure.

heart failure;ghrelin;angiotensin II;myocardial apoptosis

R541.6+1

A

2017-06-25)

國家自然科學基金(81570360,81400298)

*通訊作者

1007-4287(2017)10-1812-04

楊春艷(1980- )，女，博士，主治醫師，主要從事心力衰竭發病機制及治療研究。