催乳素處理的乳腺癌T-47D細胞lncRNA和mRNA表達譜差異分析

朱林靜，姚俊，魏欽俊，魯雅潔，曹新

南京醫科大學 基礎醫學院生物技術系，江蘇 南京 211166

研究報告

催乳素處理的乳腺癌T-47D細胞lncRNA和mRNA表達譜差異分析

朱林靜，姚俊，魏欽俊，魯雅潔，曹新

南京醫科大學 基礎醫學院生物技術系，江蘇 南京 211166

目的：觀察催乳素處理引起乳腺癌T-47D細胞中長鏈非編碼RNA（lncRNA）和mRNA表達譜的變化。方法：利用轉錄組測序技術檢測催乳素處理前后乳腺癌T-47D細胞中lncRNA和mRNA的表達譜；通過數據庫KEGG、GO富集對有差異表達且具有統計學意義的mRNA進行通路分析，得到mRNA參與的生物學途徑；運用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術對部分差異表達的 lncRNA（lnc-AK4-2、XLOC_075541、XLOC_093371、XLOC_081110、XLOC_047068、XLOC_006637、XLOC_064063、XLOC_086865、XLOC_099517、XLOC_106798、lnc-ZNF639-1）進行驗證，并利用生物信息學方法預測其靶基因，通過數據庫KEGG、GO富集對差異lncRNA的靶基因進行通路分析。結果：分析得到3564個差異lncRNA和477個差異mRNA（差異倍數＞2，P＜0.05），差異表達的mRNA主要富集在134條不同的信號通路，其中包括催乳素/催乳素受體信號通路相關的MAPK信號通路、p53信號通路和JAK-STAT信號通路；選取的11條lncRNA的變化趨勢（XLOC_093371、XLOC_006637、XLOC_064063、XLOC_086865、lnc-ZNF639-1表達上調，lnc-AK4-2、XLOC_075541、XLOC_081110、XLOC_047068、XLOC_099517、XLOC_106798表達下調）經qRT-PCR技術得到驗證；lncRNA靶基因富集的信號通路同樣包括MAPK信號通路。結論：催乳素處理前后T-47D細胞中lncRNA的表達存在明顯差異，為進一步研究與乳腺癌發病機制相關的關鍵lncRNA分子提供了基礎，并為尋找乳腺癌潛在的診療方法提供理論支持。

長鏈非編碼RNA；表達譜；乳腺癌；催乳素；T-47D細胞

乳腺癌是當今困擾女性健康的最普遍的癌癥之一，且其發病率呈逐年上升的趨勢，由于乳腺癌起病隱匿，部分乳腺癌患者檢出或確診時已屬中晚期，治療效果不甚理想，因此早期診斷、早期治療是提高生存率的關鍵[1]。目前，已經發現多種因素與乳腺癌有著密切關系。人催乳素（prolactin，PRL）是由腦垂體前葉分泌的由199個氨基酸殘基構成的一種重要的多肽類生長激素，參與正常乳腺上皮的增生和分化[2]。有實驗報道PRL在乳腺癌變過程中發揮重要作用[3]。PRL以內分泌、旁分泌及自分泌的方式與靶細胞膜表面的催乳素受體（PRL receptor，PRLR）結合并啟動相應的細胞內信號轉導過程（如MAPK信號通路、p53信號通路和JAK-STAT信號通路等），從而發揮非常廣泛的生物學作用[4]。

近年來，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在腫瘤發生、遷移及抗藥性中作為調控因子和潛在治療因子被廣泛關注[5]。lncRNA由于缺少開放讀框而不具有編碼能力，因此一直以來被認為是轉錄噪音或克隆產物而很少受到關注[6]。但是，越來越多的實驗證據表明lncRNA在人體內的異常表達與包括乳腺癌在內的多種惡性腫瘤的發生、發展關系密切[7]。

本研究利用Illumina測序平臺檢測了催乳素處理前后T-47D細胞RNA的表達譜，并結合生物信息學分析了處理組與對照組lncRNA和mRNA的表達變化，得到一系列差異明顯且具有統計學意義（差異倍數＞2，P＜0.05）的 lncRNA和mRNA。從這些差異明顯的lncRNA中選擇了11個，利用熒光定量PCR對其表達差異情況進行驗證。同時，利用生物信息學方法對這11個lncRNA進行了靶基因預測，并對這些靶基因進行了生物功能分析，結果顯示催乳素處理前后T-47D細胞ln?cRNA和mRNA的表達變化可能與乳腺癌發生發展過程中催乳素受體信號通路相關。

1 材料和方法

1.1 細胞培養與催乳素處理

乳腺癌T-47D細胞購于中國科學院上海細胞庫，由本實驗室保存，細胞在含10%胎牛血清（Hyclone公司）的RPMI1640培養基（Gibco公司）中，于37℃、5%CO2的培養箱中培養。催乳素處理T-47D細胞過程參照本實驗室之前的工作[8]，將生長密度為70%～80%的細胞分為對照組與處理組，對照組僅加完全培養基，處理組加入含150 μg/mL PRL的培養液，每組均設3個平行復孔，于37℃、5%CO2飽和濕度孵箱內培養24～48 h，提取細胞總RNA。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

用TRIzol（Invitrogen公司）分別提取催乳素處理組與對照組T-47D細胞中的總RNA，紫外分光光度計測定D260nm和D280nm值，對總RNA進行定量；計算D260nm/D280nm值，結合甲醛變性凝膠電泳，分析RNA質量。樣品中提取RNA的D260nm/D280nm值為1.8～2.0，經甲醛變性膠電泳檢測有清晰的28S、18S條帶，無降解，且28S條帶亮度約是18S的1～2倍，則認為這些樣本的RNA可用于后續實驗。

1.3 轉錄組測序

分別提取催乳素處理組與對照組T-47D細胞總RNA并用DNaseⅠ消化DNA后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA；加入打斷試劑在Thermo?mixer中將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板合成單鏈cDNA，然后配制雙鏈合成反應體系合成雙鏈cDNA，用試劑盒純化回收、粘性末端修復、cDNA的3'端加上堿基“A”并連接接頭，然后進行片段大小選擇，最后進行PCR擴增；構建的文庫經Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質檢合格后，用Illumina HiSeq 2000測序儀測序。

1.4 實時熒光定量PCR

從變化倍數在2倍以上并有顯著差異（P＜0.05）的lncRNA分子中挑選11個進行Real-time PCR驗證。分別以催乳素處理組和對照組T-47D細胞的cDNA為模板，每條lncRNA引物由在線軟件 Primer 5（http://sourceforge.net/projects/primer5/）合成，并在NCBI中經BLAST驗證，采用StepOneplus熒光定量PCR儀，SYBR Green熒光染料（Ta?KaRa公司）摻入法相對定量。以內參GAPDH為參照，計算差異表達的倍數。

1.5 差異lncRNA與mRNA的生物信息學分析

為了尋找與lncRNA相互作用的mRNA，用2種不同的算法進行lncRNA靶基因預測。第一種算法是搜尋lncRNA順式作用基因，通過在線軟件UCSC（http://genome.ucsc.edu/）直接查找到的位于lncRNA位點上游或下游10 kb范圍內轉錄的基因被認為是此lncRNA的順式作用基因[9]。第二種算法是尋找lncRNA反式作用基因，首先用BLAST比對找到在序列上有一定同源性的mRNA和lncRNA，然后利用mRNA和lncRNA的相關性對結果進行過濾，最后用RNAplex（一個用來尋找2條長鏈RNA之間短的相互作用的軟件）預測反義lncRNA與mRNA之間的互補結合[10]。

分別對預測得到的靶基因以及具有統計學意義的差異表達mRNA做進一步生物信息學分析，包括GO富集和KEGG通路分析。GO富集包括生物學過程、細胞組分、分子功能[11]。KEGG通路及GO富集分析由在線軟件DAVID（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discov?ery，https://david.ncifcrf.gov/）完成。錯誤發現率（false discovery rate，FDR）用來表示P值的有效性。FDR＜0.05表示差異具有統計學意義[12]。

2 結果

2.1 催乳素處理組與對照組lncRNA和mRNA表達模式

對轉錄組測序得到的原始數據進行清理，去除低表達量、無意義及未比對上的數據，再對數據進行標化，得到對照組樣品lncRNA和基因表達量整體的比較（圖1A），以及催乳素處理后樣品lncRNA和基因表達量整體的比較（圖1B），結果顯示該轉錄組測序檢測到的RNA信息基本全面，2組數據具有可比性。散點圖表示催乳素處理組與對照組之間RNA表達差異情況，紅色代表明顯上調的標簽，綠色代表明顯下調的標簽，中間藍色為差異不明顯的標簽（圖1C）。

此次轉錄本測序檢測到的2組樣品間差異明顯且具有統計學意義的lncRNA有3564條，其中586條為已知lncRNA，它們的信息可以從http://ln?cipedia.org/db/search獲得。為了進一步分析這些差異lncRNA，分別對它們的染色體位置和長度信息進行了整理，結果見圖1D和1E。

2.2 差異mRNA的GO和KEGG分析

對所有差異明顯且具有統計學意義的mRNA進行GO分析，篩選標準為q值＜0.05，得到這些差異表達mRNA分別在基因本體論三個功能方面的富集表達譜。圖2A、B和C為催乳素處理組和對照組比較所得差異mRNA的GO分析。結果顯示在生物學進程方面，差異mRNA顯著富集于16條通路（圖2A）；在細胞組件方面，差異mRNA顯著富集于9條通路（圖2B）；在分子功能方面，差異mRNA顯著富集于8條通路（圖2C）。

催乳素處理組與對照組差異mRNA的KEGG分析結果顯示，這些mRNA顯著富集于p53、JAKSTAT、MAPK等信號通路（圖2D），而這些信號通路與PRL/PRLR信號通路明顯相關。

2.3 差異lncRNA的定量驗證及其靶基因的功能富集分析

從催乳素處理T-47D細胞前后差異明顯且具有統計學意義的全部lncRNA分子中選取11條（5條上調，6條下調）（表1）進行實驗驗證，熒光定量結果顯示這11條差異lncRNA的表達變化與測序結果一致（圖3A）。對所選差異表達的lncRNA相關基因進行GO分析，結果顯示在生物學進程方面，相關基因顯著富集于8條通路（圖3B）；在細胞組件方面，相關基因顯著富集于2條通路（圖3C）；在分子功能方面，相關基因顯著富集于6條通路（圖3D）。對所選差異表達的lncRNA相關基因應用DAVID數據庫進行KEGG分析，發現其在PRL/PRLR相關的一條信號通路，即MAPK信號通路中顯著富集（圖3E）。

圖1 催乳素處理組與對照組lncRNA和mRNA表達譜差異分析

3 討論

轉錄組測序是指用新一代高通量測序技術對物種或組織的轉錄本進行測序并得到相關的轉錄本信息，它的研究對象為特定細胞在某一功能狀態下所能轉錄出來的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA[13]。本實驗采用的基于Illu?mina高通量測序平臺的轉錄組測序技術能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉錄活動進行檢測。在分析轉錄本的結構和表達水平的同時，還能發現未知轉錄本和稀有轉錄本，精確地識別可變剪切位點及SNP（編碼序列單核苷酸多態性），提供最全面的轉錄組信息[14]。另外，通過熒光定量PCR對轉錄組測序結果進行隨機驗證，結果也證實了該測序手段的可靠性。在本實驗中，分別發現了3564和477個顯著差異的lncRNA和mRNA，這為后續探討乳腺癌發病機制及發病過程中的關鍵分子提供了寶貴的數據。

1977年，首次有報道指出催乳素對乳腺癌的發病機制和發展進程具有顯著作用[15]。許多研究報道指出催乳素是乳腺癌上皮細胞主要的分化因素[16-18]。LncRNA是一類缺乏編碼蛋白能力，位于細胞核或胞質內的非編碼RNA分子，已有大量研究表明[19-21]，lncRNA表達失調在腫瘤的發生發展過程中發揮著重要的作用。但是，至今仍未有關于催乳素介導的乳腺癌細胞中lncRNA異常表達的研究報道。在此，本文較深入地分析了催乳素處理前后T-47D細胞中lncRNA的表達情況，從而探討催乳素介導的通過催乳素受體信號通路對乳腺癌細胞中lncRNA表達的調控。通過對差異mRNA和差異lncRNA相關基因的KEGG分析，結果提示這些差異基因主要富集在催乳素/催乳素受體信號通路相關信號通路上，這可能歸因于催乳素的誘導表達。

圖2 催乳素處理組與對照組差異mRNA的GO和KEGG分析

表1 長鏈非編碼RNA的靶基因預測

總之，本文首次報道了催乳素處理乳腺癌T-47D細胞后RNA的差異表達譜，而這些差異RNA在乳腺癌中的生物功能及分子機制仍有待更深入的研究。同時，本實驗為進一步闡明由催乳素誘導表達引起的乳腺癌的發病機制，通過調控關鍵lncRNA尋找其新的藥物靶點提供了新的依據。

圖3 差異lncRNA的熒光定量PCR驗證及其靶基因的GO和KEGG分析

[1]范雅文,張旭.三陰乳腺癌的異質性及靶向治療[J].生物技術通訊,2015,26(3):442-444.

[2]Carver K C,Arendt L M,Schuler L A.Complex pro?lactin crosstalk in breast cancer:new therapeutic im?plications[J].Mol Cell Endocrinol,2009,307(1):1-7.

[3]Tworoger S S，Hankinson S E．Prolactin and breast cancer risk[J].Cancer Lett,2006,243(2):160-169.

[4]譚敦勇,彭湘萍.催乳素受體研究[J].生理科學進展,2012,43(1):17-23.

[5]馮維熙,曹新.基于目標基因芯片數據預測lncRNAs調控腦缺血再灌注損傷后的作用效應[J].生命科學研究，2016,20(3):235-242.

[6]Chen J,Fu Z Y,Ji C,et al.Systematic gene microar?ray analysis of the lncRNA expression profiles in hu?man uterine cervix carcinoma[J].Biomed Pharmacoth?er,2015,72:83-90.

[7]Brunner A L,Beck A H,Edris B,et al.Transcription?al profiling of long non-coding RNAs and novel tran?scribed regions across a diverse panel of archived hu?man cancers[J].Genome Biol,2012,13(8):1-13.

[8]Wei Q J,He W,Yao J,et al.Identification and char?acterization of microRNAs expressed in human breast cancer T-47D cells in response to prolactin treatment by Solexa deep-sequencing technology[J].Biochem Bio?phys Res Commun,2013,432(3):480-487.

[9]Han L,Zhang K,Shi Z,et al.LncRNA profile of glio?blastoma reveals the potential role of lncRNAs in con?tributing to glioblastoma pathogenesis[J].Int J Oncol,2012,40(6):2004-2012.

[10]Tafer H,Hofacker I L.RNAplex:a fast tool for RNARNA interaction search[J].Bioinformatics,2008,24(22):2657-2663.

[11]Lin X C,Zhu Y,Chen W B,et al.Integrated analy?sis of long non-coding RNAs and mRNA expression profiles reveals the potential role of lncRNAs in gas?tric cancer pathogenesis[J].Int J Oncol,2014,45(2):619-628.

[12]Kanehisa M,Goto S.KEGG:kyoto encyclopedia of genes and genomes[J].Nucleic Acids Res,2000,28(1):27-30.

[13]Zhu L,Mok S,Imwong M,et al.New insights into the Plasmodium vivax transcriptome using RNA-Seq[J].Sci Rep,2016,6:20498.

[14]Huang X,Jing Y,Liu D J,et al.Whole-transcrip?tome sequencing of Pinellia ternata using the Illumina platform[J].Genet Mol Res,2016,15(2):gmr.15028062.

[15]Welsch C W,Nagasawa H.Prolactin and murine mam?mary tumorigenesis:a review[J].Cancer Res,1977,37(4):951-963.

[16]Liu F,Pawliwec A,Feng Z,et al.Prolactin/Jak2 di?rects apical/basal polarization and luminal linage matu?ration of mammary epithelial cells through regulation of the Erk1/2 pathway[J].Stem Cell Res,2015,15(2):376-383.

[17]Kobayashi K,Tsugami Y,Matsunaga K,et al.Prolac?tin and glucocorticoid signaling induces lactation-spe?cific tight junctions concurrent with beta-casein ex?pression in mammary epithelial cells[J].Biochim Bio?phys Acta,2016,1863(8):2006-2016.

[18]Medina-Estrada I,Alva-Murillo N,Lopez-Meza,et al.Non-classical effects of prolactin on the innate im?mune response of bovine mammary epithelial cells:Im?plications during Staphylococcus aureus internalization[J].Microb Pathog,2015,89:43-53.

[19]Jiang J F,Sun A J,Xue W,et al.Aberrantly ex?pressed long noncoding RNAs in the eutopic endome?tria of patients with uterine adenomyosis[J].Eur J Ob?stet Gynecol Reprod Biol,2016,199:32-37.

[20]Chen Y,Wu J J,Lin X B,et al.Differential lncRNA expression profiles in recurrent gliomas compared with primary gliomas identified by microarray analysis[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(4):5033-5043.

[21]Zhan Y,Lin J,Liu Y,et al.Up-regulation of long non-coding RNA PANDAR is associated with poor prognosis and promotes tumorigenesis in bladder cancer[J].J Exp Clin Cancer Res,2016,35(1):83.

Comprehensive Investigation on the Expression Profiles of Long Noncoding RNAs and mRNAs in Breast Cancer T-47D Cells Treated with Prolactin

ZHU Lin-Jing,YAO Jun,WEI Qin-Jun,LU Ya-Jie,CAO Xin*
Department of Biotechnology,School of Basic Medical Science,Nanjing Medical University,Nanjing 211166,China

Objective:To analyze the variation of long non-coding RNA（lncRNA） and mRNA expression pro?files in breast cancer T-47D cells after they were treated with prolactin（PRL）.Methods:RNA-seq was used to detect the lncRNA and mRNA expression profile in T-47D cells before and after PRL treatment.The statistically differential expressed mRNA were selected for Gene ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）pathway.Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）was used to validate the 11 differentially expressed ln?cRNA,and their target genes were predicted by bioinformatcs,and biological pathways those genes involved in were analyzed by GO and KEGG.Results:3564 lncRNA and 477 mRNA were detected with varied expression（fold＜0.5 or ＞2.0,P＜0.05） in T-47D cells.GO and KEGG analysis indicated that these differentially expressed mRNA were mainly implicated in 134 pathways,of which the MAPK signaling pathway,p53 signaling pathway and JAK-STAT signaling pathway were included in the PRL/PRL receptor（PRLR） signaling pathway.The qRTPCR analysis of 11 selected lncRNA（XLOC_093371,XLOC_006637,XLOC_064063,XLOC_086865,lnc-ZNF639-1 up-regulated;lnc-AK4-2,XLOC_075541,XLOC_081110,XLOC_047068,XLOC_099517,XLOC_106798 downregulated）confirmed the results of RNA-seq,and their targets are also enriched in the MAPK signaling pathway.Conclusion:Significant variation of lncRNA expression in T-47D cells was detected before and after PRL treat?ment,which may provide a useful database for further investigation on lncRNA' function and mechanism in breast cancer,and contribute to find potential diagnostic and therapeutic targets for breast carcinoma.

long non-coding RNA;expression profile;breast cancer;prolactin;T-47D cells

Q78;Q811.4

A

1009-0002（2017）05-0577-07

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:caoxin@njmu.edu.cn

2017-03-01

國家自然科學基金（81172142）；國家自然科學基金青年基金（51403103）

朱林靜（1991- ），女，碩士研究生，（E-mail）1115020628@qq.com；姚俊（1979- ），男，講師；二者為并列第一作者

曹新，（E-mail）caoxin@njmu.edu.cn