RRAGD-EGFP融合蛋白在MDA-MB-436細胞中的表達定位

張崢嶸，鄭幽，阮班展，王嫚娜，梁劍青，李世崇，黃紅艷，閆敏，陳昭烈，劉真真，孫強

1.鄭州大學附屬腫瘤醫院 乳腺科，河南 鄭州 450008；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071；3.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院 腫瘤內科，腫瘤治療性疫苗北京市重點實驗室，北京 100038

RRAGD-EGFP融合蛋白在MDA-MB-436細胞中的表達定位

張崢嶸1，2，鄭幽2，阮班展2，王嫚娜2，梁劍青2，李世崇2，黃紅艷3，閆敏1，陳昭烈2，劉真真1，孫強2

1.鄭州大學附屬腫瘤醫院 乳腺科，河南 鄭州 450008；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071；3.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院 腫瘤內科，腫瘤治療性疫苗北京市重點實驗室，北京 100038

目的：構建RRAGD-EGFP融合基因表達載體pQCXIP-RRAGD-EGFP，并檢測RRAGD-EGFP融合蛋白在MDA-MB-436細胞中的表達定位。方法：提取HEK293細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA并擴增RRAGD基因，克隆入逆轉錄載體pQCXIP-EGFP-N1，病毒包裝后感染人乳腺癌細胞系MDA-MB-436，活細胞觀察其在細胞內的表達定位。結果：構建獲得逆轉錄病毒載體pQCXIP-RRAGD-EGFP，融合蛋白RRAGD-EGFP定位于胞漿囊泡和細胞核。結論：RRAGD-EGFP融合蛋白在MDA-MB-436細胞中表達定位于胞漿囊泡，與其參與溶酶體調節功能一致，為后續分析RRAGD在cell-in-cell中的作用奠定了基礎。

Ras相關GTP結合蛋白D（RRAGD）；基因克隆；cell-in-cell

Ras相關GTP結合蛋白D（Ras-related GTP binding protein D，RRAGD）由400個氨基酸殘基組成，相對分子質量為45 588。RRAGD基因位于染色體6q15，編碼區長1200 bp[1]。

RRAGD是GTR/RAG GTP結合蛋白家族的一員，哺乳動物體內的該家族成員還包括RRAGA、RRAGB、RRAGC[2-3]。這4種蛋白在結構上均有能與GTP/GDP結合的Loop環和異二聚化結構域，從而決定了其在功能上具有小G蛋白活性和異二聚化的能力。因此，它們作為一個分子開關參與生物過程[4]。另外，它們兩兩結合，形成了RRAG A/B-C/D異二聚體（其中RRAGA和RRAGB、RRAGC與RRAGD是同源類似物），又稱Rag復合體（Rag complex）[3,5-8]。該復合體可與溶酶體上的Ragulator結合并被氨基酸激活，促進mTORC1（mTOR complex 1）從胞漿轉移到溶酶體膜表面，并被溶酶體膜上重要的小G蛋白Rheb（Ras ho?molog enriched in brain）激活[9-11]。

為了在活細胞中研究RRAGD的定位分布，我們擬構建RRAGD與綠色熒光蛋白的融合表達載體。為此，我們提取了HEK293細胞中的RNA，逆轉錄得到cDNA后擴增RRAGD基因，連入逆轉錄表達載體pQCXIP-EGFP-N1得到pQCXIPRRAGD-EGFP，進一步在MDA-MB-436細胞中檢查了融合蛋白的亞細胞定位。

1 材料和方法

1.1 材料

MDA-MB-436細胞系來自美國ATCC細胞庫，293FT細胞和HEK293細胞為本實驗室保存（均采用Macgene公司的DMEM培養基培養）；大腸桿菌Trans10和反轉錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；載體pQCXIP-EGFP-N1由本實驗保存；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒快速提取試劑盒和質粒無內毒素提取試劑盒均購自天根公司；TRIzol購自Ambion公司；T載體購自Pro?mega公司；Q5高保真DNA聚合酶，限制性內切酶BglⅡ、AgeⅠ、XhoⅠ，T4DNA 連接酶購自NEB 公司；LipofectAMINE 2000、嘌呤霉素均購自Invitro?gen公司；玻璃底30 mm培養皿購自NEST公司。

1.2 HEK293總RNA的提取和反轉錄PCR

收獲2×107HEK293細胞，加入1 mL TRIzol，吹打數次后吸入離心管，室溫靜止5 min使其充分裂解；加入0.2 mL氯仿，振蕩混勻后室溫靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心15 min；取上清至另一離心管中，加入等量的異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入1 mL 75%乙醇，輕輕懸浮沉淀，4℃、7500 r/min離心 5 min，棄上清；晾干，加入 20 μL DEPC 水溶解（65℃，促溶 10～15 min）；定量RNA。取1 μg總RNA進行反轉錄（反轉錄體系：1 μg RNA，1 μL Primer，10 μL Re?action Mix，1 μL Enzyme Mix，1 μL Remover，DHPC水補齊至20 μL），將上述體系混勻，42℃、30 min反轉錄，85℃、5 min使反轉錄酶失活。

1.3 RRAGD基因擴增和RRAGD-EGFP融合基因表達載體構建

以得到的cDNA為模板擴增RRAGD基因，引物 為 F1（5'-CGCTCGAGATGAGCCAGGTGCTGGG GAAGC-3'）和 R1（5'-CGACCGGTCGCAGCAGCA CTCTAGGGGTCCCAT-3'）。PCR 擴 增 條 件 ：95℃10 s，62℃ 15 s，72℃ 45 s，30個循環。PCR使用Q5高保真聚合酶。膠回收擴增產物，用Taq酶加A后連入pGEM-T載體，經XhoⅠ/AgeⅠ酶切鑒定正確后測序，測序正確后回收目的片段，連入pQCXIP-EGFP-N1載體的XhoⅠ/AgeⅠ位點，得到逆轉錄表達載體pQCXIP-RRAGD-EGFP（圖1）。

1.4 病毒包裝、感染

293FT細胞按 1×106/孔接種于6孔板，37℃、5%CO2條件下培養過夜。將目的逆轉錄病毒載體與包裝質粒Gag/Pol、VSVG-R用脂質體Lipo?fectAMINE 2000共轉染293FT細胞，6 h后換液，于24、48、72 h收取上清，用4.5 μm濾器過濾。將MDA-MB-436細胞按2×105/孔的密度接種于6孔板，每孔加入1 mL DMEM培養基、1 mL病毒上清和1.5 μL Polybrene，48 h后用嘌呤霉素（1 μg/mL）篩選4～5 d，獲得穩定目的細胞株。

圖1 pQCXIP-RRAGD-EGFP表達載體的構建示意圖

1.5 活細胞觀察RRAGD-EGFP融合蛋白在MDAMB-436細胞中的分布

分別取目的細胞與未轉染的普通MDA-MB-436細胞2×105個，種于30 mm玻璃底培養皿中，37℃、5%CO2條件下培養過夜，12 h后在寬場活細胞熒光顯微鏡下，在FITC和明場下對RRAGDEGFP陽性細胞拍攝照片。

2 結果

2.1 pQCXIP-RRAGD-EGFP表達載體的構建

用引物F1和R1擴增所得產物約為1200 bp，與預期大小相符，提示擴增成功（圖2A）。將擴增所得片段連入T載體，用XhoⅠ/AgeⅠ酶切鑒定，電泳顯示片段大小正常（圖2B），同時測序顯示序列無突變（序列未示）。膠回收目的片段，連入逆轉錄病毒載體pQCXIP-EGFP-N1，轉化后挑2個克隆（C1、C2），分別用XhoⅠ/AgeⅠ、BglⅡ/AgeⅠ雙酶切鑒定，DNA電泳片段和模式與預期相符（圖2C），測序顯示插入序列正確無誤（序列未示），證明pQCXIP-RRAGD-EGFP表達載體構建成功。

圖2 RRAGD基因的PCR擴增和表達載體酶切鑒定

2.2 RRAGD-EGFP融合基因的表達定位分析

已知RRAGD蛋白主要分布于細胞的胞漿、胞核和溶酶體，可能依賴于與其相關的核苷酸結合狀態而進出胞核。與此一致，我們發現MDAMB-436細胞中的RRAGD-EGFP蛋白表達分布在胞漿和胞核中，同時在胞漿囊泡中有特異性分布（圖3）。研究表明，在entosis（細胞侵入性死亡）的后期，mTORC1所調節的液泡分裂參與內部死亡細胞的代謝[12]，而RRAGD作為募集mTORC1的關鍵分子，其在cell-in-cell結構中的表達分布仍未見報道，因此我們利用活細胞工作站觀察RRAGD-EGFP在cell-in-cell結構中的表達分布變化。結果顯示當內部細胞進入死亡狀態時，外部細胞的RRAGD-EGFP會聚集在內部細胞周圍，有明顯的聚集效應；而內部細胞處于活的狀態時，無此聚集效應（圖3）。提示RRAGD可能參與了cell-in-cell結構中內部細胞的死亡及代謝過程。

圖3 Cell-in-cell結構中外部細胞的RRAGD-EGFP融合蛋白定位

3 討論

通過建立表達RRAGD-EGFP融合蛋白的細胞系，為我們在活細胞水平研究RRAGD的表達及功能提供了便利：一方面，EGFP是無毒的，對細胞的生存狀態沒有影響，因此便于在熒光顯微鏡下長時間進行活細胞觀察，明確其表達分布的變化；另一方面，可以省去復雜的免疫熒光染色，同時簡化Western印跡實驗的抗體選擇。

RRAGD在多種組織，如皮膚、心臟、脊髓、睪丸和視網膜等中均有表達。RRAGD可以參與多種信號通路，尤其是其異二聚體復合物調節mTORC1活性的功能，具有很重要的生理意義[7]。我們前期研究發現RRADG在乳腺癌細胞系的不同單克隆細胞株中表達差異很大，同時與乳腺癌細胞的cell-in-cell形成率具有一定的相關性，因此，通過構建表達RRAGD-EGFP融合蛋白的細胞系，為探討RRAGD對cell-in-cell形成能力的作用及機制研究提供了合適的研究模型。

此外，在cell-in-cell結構中，內部細胞是被外部細胞所形成的液泡包裹的，部分液泡的命運與吞噬小體類似——液泡在外部細胞內經歷一定的事件后達到成熟，其成熟末期的標志即液泡的分解，液泡分裂后其內部營養和遺傳物質進入外部細胞并被利用[12]。在我們的實驗中發現，內部細胞處于死亡狀態時，外部細胞的RRAGD-EGFP有明顯的聚集效應，這一過程是否是通過募集mTORC1參與調節液泡的成熟,進而促進內部細胞的死亡還有待研究。同時，RRAGD及其形成的異二聚體復合物的活化是否能決定cell-in-cell結構中內部細胞的命運，也值得深入探索。

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Expression and Subcellular Localization of RRAGD-EGFP Fusion Protein in MDA-MB-436 Cells

ZHANG Zheng-Rong1,2,ZHENG You2,RUAN Ban-Zhan2,WANG Man-Na2,LIANG Jian-Qing2,LI Shi-Chong2,HUANG Hong-Yan3,YAN Min1,CHEN Zhao-Lie2,LIU Zhen-Zhen1*,SUN Qiang2*
1.Department of Breast,Cancer Hospital,Zhengzhou University,Zhengzhou 450008;2.Beijing Institute of Biotech?nology,Beijing 100071;3.Beijing Key Laboratory of Oncology and Oncology Vaccine,Beijing Shijitan Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100038;China

Objective:To construct the retroviral expression vector for RRAGD-EGFP fusion protein,and exam?ine its subcellular localization in MDA-MB-436 cells.Methods:Total RNA was extracted from HEK293 cells and reverse transcribed into cDNA.RRAGD（Ras-related GTP binding protein D）gene was amplified by PCR and cloned into the retroviral expression vector pQCXIP-EGFP-N1 to construct pQCXIP-RRAGD-EGFP,followed by retrovirus was made and infected MDA-MB-436,a cell line of breast cancer.Afterwards,time lapse imaging was performed.Results:The retroviral expression vector for RRAGD-EGFP fusion protein was successfully constructed.RRAGD-EGFP fusion protein was found in cytoplasmic vesicles and nucleus.Conclusion:Localization of RRAGDEGFP fusion protein in cytoplasmic vesicles is consistent with its role in lysosomal biogenesis,which has laid foun?dation for the further study on the role of RRAGD in cell-in-cell.

Ras-related GTP binding protein D（RRAGD）;gene cloning;cell-in-cell

Q78

A

1009-0002（2017）05-0639-04

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,LIU Zhen-Zhen,E-mail:Liuzhenzhen73@163.com;SUN Qiang,E-mail:sunq@bmi.ac.cn

2017-04-05

國家自然科學基金（81572799，31671432）；國家重點研發計劃（2016YFC1303303）；北京市自然科學基金（7162091）

張崢嶸（1991- ），男，碩士研究生，（E-mail）18703605958@163.com；鄭幽（1989- ），女，助理研究員；二者為共同第一作者

劉真真，（E-mail）Liuzhenzhen73@163.com；孫強，（E-mail）sunq@bmi.ac.cn