Runx2真核表達載體的構建及其對骨肉瘤細胞增殖的影響

代建寧，鄧彩霞，景調平，姥偉，楊海旭

解放軍第五醫院 a.骨科中心；b.高壓氧；c.麻醉手術科；寧夏 銀川 750004

Runx2真核表達載體的構建及其對骨肉瘤細胞增殖的影響

代建寧a，鄧彩霞b，景調平c，姥偉a，楊海旭a

解放軍第五醫院 a.骨科中心；b.高壓氧；c.麻醉手術科；寧夏 銀川 750004

目的：構建人源Runx2過表達重組載體，探討Runx2對骨肉瘤細胞增殖能力的影響。方法：以HEK293細胞總RNA為模板，反轉錄為cDNA，通過PCR技術擴增Runx2全長基因并連接至真核表達質粒pcDNA3.1，篩選陽性克隆進行序列測定后，轉染至骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS，通過MTT實驗驗證Runx2調節細胞增殖的能力。結果：構建了pcDNA3.1-Runx2真核表達載體，并在骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS中高表達Runx2蛋白；Runx2高表達后，骨肉瘤細胞增殖能力顯著增加。結論：構建了Runx2基因高效真核表達載體，并證明Runx2可以促進骨肉瘤細胞的增殖。

Runx2；真核表達載體；骨肉瘤細胞；細胞增殖

骨肉瘤嚴重威脅著人們健康，高發于青少年人群，位列青少年腫瘤第三位，僅次于淋巴瘤和腦腫瘤[1]。根據其組織成分，可將骨肉瘤的亞型分為成骨細胞型、成軟骨細胞型、成纖維細胞型、成韌帶型和小細胞型。深入探討其發生機制，對于骨肉瘤的診斷和治療均具有重要意義。Runx2（Runt-related transcription factor 2）是 Runt相關轉錄因子家族成員。前期研究表明，Runx2在成骨分化的信號途徑中發揮重要作用，能誘導間充質干細胞向成骨細胞定向分化和成熟，促進骨組織的發育和傷口愈合[2-3]。本研究中，我們構建了Runx2的高效真核表達載體，并驗證了其對骨肉瘤細胞增殖能力的影響，為后續研究Runx2在骨肉瘤細胞發生發展中的作用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293細胞、骨肉瘤細胞系Saos-2和U2-OS購自中國科學院細胞庫；大腸桿菌TOP10、限制性內切酶及連接酶購自TaKaRa公司；pcDNA3.1真核表達質粒和脂質體2000購自Invitrogen公司；抗體 Runx2購自 Cell Signaling Technology（CST）公司；β-actin購自博士德公司。

1.2 pcDNA3.1-Runx2真核表達載體的構建

提取HEK293細胞總RNA并反轉錄成cDNA，根據Runx2的編碼序列設計引物，通過反轉錄PCR擴增Runx2的mRNA。上游引物序列為5'-GATATCATGGTGGCCGGGACCCGC-3'，酶 切 位 點為EcoRⅤ；下游引物序列為5'-CTCGAGTCAATA TGGTCGCCAAAC-3'，酶切位點為XhoⅠ。PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸90 s，重復35個循環；72℃充分延伸30 min。經DNA電泳證明序列位置正確后，回收PCR產物，用EcoRⅤ和XhoⅠ對pcDNA3.1和Runx2擴增產物雙酶切，經連接、轉化實驗后，挑取陽性克隆進行酶切鑒定和DNA測序。

1.3 pcDNA3.1-Runx2轉染骨肉瘤細胞

分別將5×105骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS接種至6孔板，待細胞密度長至約60%時進行轉染。將pcDNA3.1（陰性對照）或pcDNA3.1-Runx2質粒4 μg、脂質體2000 10 μL在400 μL無血清培養液中混勻，轉染至細胞。轉染一定時間后進行后續實驗。

1.4 Western印跡實驗

轉染48 h后分別收取陰性對照pcDNA3.1、過表達pcDNA3.1-Runx2的骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS，用預冷的PBS溶液洗滌3次，加入RIPA蛋白裂解液，超聲波裂解細胞提取蛋白；離心后，收取蛋白上清，通過BCA定量法對各組蛋白進行定量；按照一定體積加入5×上樣緩沖液，于沸水中10 min，保證蛋白充分變性；取30 μg蛋白樣品進行蛋白電泳實驗（SDS-PAGE），濃縮膠電壓為120 V，分離膠電壓為160 V；電泳畢，將凝膠上的蛋白轉移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，用5%脫脂奶粉封閉1 h；分別用Runx2抗體（1∶5000稀釋）和β-actin抗體（1∶500稀釋）與NC膜于4℃孵育過夜，次日用含0.5%Tween-20的TBST洗3次，5 min/次，再加入相應結合的二抗后，與ECL發光檢測劑結合顯示結果。

1.5 MTT法檢測細胞活力

陰性對照pcDNA3.1、過表達pcDNA3.1-Runx2的骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS轉染24 h后，將各組細胞用含10%血清的培養液制成單個細胞懸液，以104/孔接種到96孔板，每孔體積200 μL；分別在培養0、24、48、72 h后進行MTT實驗（每孔加入5 mg/mL的MTT溶液，孵育4 h后終止培養，小心吸棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解）；在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的D490nm值，以時間為橫坐標、D490nm值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

2 結果

2.1 pcDNA3.1-Runx2重組質粒的構建和鑒定

以HEK293細胞的cDNA作為模板，經PCR反應擴增出Runx2編碼區域，條帶位置為1000～2000 bp，與Runx2全長（1566 bp）相符（圖1）。將Runx2和pcDNA3.1分別用EcoRⅤ和XhoⅠ雙酶切后連接轉化大腸桿菌感受態TOP10，挑取克隆提取質粒并進行酶切鑒定。經EcoRⅤ和XhoⅠ雙酶切鑒定，發現1～4號克隆均可在1000～2000 bp位置切得條帶，經測序鑒定正確后進行后續實驗（圖2）。

2.2 pcDNA3.1-Runx2轉染骨肉瘤細胞后高表達Runx2蛋白

為了驗證Runx2是否能在真核細胞中正確轉錄和翻譯，將pcDNA3.1-Runx2質粒和陰性對照pcDNA3.1空載體瞬時轉染骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS。Western印跡實驗發現，與陰性對照相比，轉染pcDNA3.1-Runx2質粒的細胞中Runx2蛋白水平顯著升高，這表明pcDNA3.1-Runx2質粒能在真核細胞中表達（圖3）。

圖1 Runx2基因PCR產物電泳圖譜

圖2 重組質粒pcDNA3.1-Runx2的EcoRⅤ/XhoⅠ雙酶切電泳圖譜

圖3 Western印跡檢測Runx2在各細胞中的蛋白表達

2.3 Runx2促進了骨肉瘤細胞的增殖能力

我們分析了Runx2是否對骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS的增殖具有調控作用。分別選擇不同時間點（0、24、48、72 h）進行MTT實驗，發現轉染pcDNA3.1-Runx2質粒的細胞增殖能力顯著高于陰性對照細胞，差異具有統計學意義（P＜0.001）（圖4）。這一結果說明，Runx2可以在骨肉瘤細胞Saos-2和U2-OS中促進細胞的增殖。

圖4 MTT法檢測骨肉瘤細胞生長曲線

3 討論

Runx2是細胞內重要的轉錄因子，屬于Runt相關轉錄因子家族，包含Runt DNA結合結構域。以往研究顯示，Runx2對成骨細胞的分化和骨骼形態發生至關重要，是間充質干細胞向成骨細胞分化的特異性轉錄調節因子，通過調控骨骼發育相關基因的表達發揮功能[4-5]。高表達的Runx2是成骨細胞初始分化的標志，它也是骨形成過程中最早和最具特異性的標志基因。在生物進化過程中，Runx2基因高度保守，當Runx2基因表達缺失時將導致骨發育不良或終止[6]。此外，Runx2還參與了多種信號轉導途徑，可以受到骨形態發生蛋白、胰島素樣生長因子、甲狀腺激素、成纖維細胞生長因子等多種因素的影響，對成骨細胞和破骨細胞均有效應，在骨代謝過程中發揮著關鍵作用[7-9]。

Runx2與多種腫瘤的發生發展密切相關。在乳腺癌中，Runx2高表達可以促進MMP-13、MMP-9、VEGF等轉移相關基因的表達，促進細胞的侵襲和遷移能力[10-11]；在前列腺癌中，Runx2的過表達會上調Sox9、Snail2等轉錄因子的表達，誘導細胞上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT）過程的發生[12-13]；在肝癌中，Runx2通過直接結合長鏈非編碼RNA MT1DP啟動子，抑制其表達并促進肝癌細胞的增殖[14]；在結腸癌中，Runx2可以與ETS-1結合，促進遷移相關基因的表達，促進腫瘤侵襲和轉移過程[15]。

本研究中，我們以骨肉瘤細胞系作為研究模型，通過重組DNA技術構建了pcDNA3.1-Runx2真核表達載體，并發現pcDNA3.1-Runx2可以在Saos-2和U2-OS細胞中誘發Runx2蛋白的高表達，功能實驗進一步證實Runx2的高表達會顯著促進骨肉瘤細胞的增殖能力。這一研究為后續探討Runx2在骨肉瘤細胞中促增殖的功能及相關機制打下了基礎。

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Construction of RunX2 Expression Plasmid and its Promo?tive Role on Osteosarcoma Cell Proliferation

DAI Jian-Ninga,DENG Cai-Xiab,JING Diao-Pingc,LAO Weia*,YANG Hai-Xua*
a.Department of Orthopedics;b.Department of Hyperbaric Oxygen;c.Department of Anesthesiology;the 5th Hos?pital of PLA,Yinchuan 750004,China

Objective:To investigate the effect of Runx2 on the osteosarcoma cells proliferation.Methods:The total RNA was extracted from HEK293 cells,from which the Runx2 full length cDNA was amplified through RTPCR,and itwas cloned into pcDNA3.1 vector.The positive plasmid wasselected and transfected into osteosarcoma cells Saos-2 and U2-OS,and biological function of Runx2 was examined through MTT assay.Results:We constructed Runx2 expression plasmid,and confirmed the highly expression ofRunx2 after transfection of pcDNA3.1-Runx2 in Saos-2 and U2-OS cells.Runx2 over-expression induced cell proliferation.Conclusion:Runx2 can accelerate osteosarcoma cell proliferation.

Runx2;mammal expression vector;osteosarcoma cells;cell proliferation

Q78;Q25

A

1009-0002（2017）05-0643-04

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,LAO Wei,E-mail:mulaowei@126.com;YANG Hai-Xu,E-mail:bioyhx@126.com

2017-01-12

代建寧（1978- ），男，本科學歷，主治醫師

姥偉，（E-mail）mulaowei@126.com；楊海旭，（E-mail）bioyhx@126.com