CD19蛋白截短體慢病毒表達載體的構建及其在K562細胞中的表達

張崢嶸，王嫚娜，梁劍青，李世崇，黃紅艷，閆敏，陳昭烈，劉真真，孫強

1.鄭州大學 附屬腫瘤醫院乳腺科，河南 鄭州 450008；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071；3.首都醫科大學 附屬北京世紀壇醫院腫瘤內科，腫瘤治療性疫苗北京市重點實驗室，北京 100038

CD19蛋白截短體慢病毒表達載體的構建及其在K562細胞中的表達

張崢嶸1，2，王嫚娜2，梁劍青2，李世崇2，黃紅艷3，閆敏1，陳昭烈2，劉真真1，孫強2

1.鄭州大學 附屬腫瘤醫院乳腺科，河南 鄭州 450008；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071；3.首都醫科大學 附屬北京世紀壇醫院腫瘤內科，腫瘤治療性疫苗北京市重點實驗室，北京 100038

目的：構建胞內段缺失的CD19蛋白截短體（CD19t）慢病毒表達載體pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro，并建立穩定表達CD19t的人紅白血病細胞系K562/CD19t。方法：合成CD19t基因全長，酶切產物插入慢病毒載體pLVXEF1α-IRES-Puro，將重組質粒轉染293FT細胞包裝病毒后感染人紅白血病細胞系K562，采用Western印跡和免疫熒光技術檢測CD19t在K562細胞中的表達，并通過ELISA檢測K562/CD19t與CD19 CAR-Jurkat共培養上清中的IL-2濃度。結果：酶切鑒定與測序結果表明成功構建慢病毒表達載體pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro；Western印跡和免疫熒光檢測到K562/CD19t細胞中CD19t的表達；ELISA結果顯示表達的CD19t能夠刺激識別CD19的CAR-Jurkat細胞分泌IL-2。結論：構建了CD19蛋白截短體慢病毒表達載體，并在K562細胞中表達,有助于進一步構建B細胞白血病動物模型和驗證CAR-T效能。

CD19；基因克隆；B細胞；CAR-T免疫療法

CD19分子，又名Leu-12或B4，最早于1983年被Naderl等發現[1]。CD19基因位于第16條染色體短臂16p11.2，由15個外顯子組成，編碼556個氨基酸殘基[2]。CD19表達于正常成熟B細胞、惡性B細胞和B前體細胞，在成熟B細胞中的表達量約是未成熟B細胞中的3倍[3-4]。CD19分子屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，只有一個跨膜區，胞內段是C端，胞外段是N端[5]。胞外區包括2個C2型免疫球蛋白樣的結構域和1個N端糖基化位點，C2球蛋白結構域間由硫鍵相連。多個實驗證明，其胞內區域是高度保守的，并且包含3個具有重要功能的酪氨酸殘基Y391、Y482和Y513[4,6]。

CD19參與了B細胞的活化、發育過程，其結構基礎是CD21-CD19-CD81復合物，該復合物降低了B細胞固有或受體依賴的信號閾值，同時還能不依賴B細胞受體的存在，與C3d結合影響B細胞受體信號途徑[7-9]。近年來，CD19分子作為B細胞的標記分子的作用越來越受到重視：一方面，CD19可以作為白血病免疫細胞分型依據[10]；另一方面，在B細胞惡性腫瘤治療領域，CD19能夠作為一個重要的治療靶點，尤其是靶向CD19分子的嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）T細胞療法在近年的臨床實驗中獲得了很大的成功[11]。

考慮到CD19全長會降低慢病毒對淋巴細胞的感染效率，我們擬構建截短的CD19蛋白（CD19t）慢病毒表達載體并感染K562細胞，通過ELISA確定其對識別CD19的CAR-Jurkat的刺激作用，為進一步研究CD19分子在B細胞惡性腫瘤中的作用和驗證CAR-T的效能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

Jurkat細胞購自北京協和細胞資源中心（采用Hyclones公司的RPMI1640培養基培養）；293FT細胞、K562細胞為本實驗室保存（293FT細胞采用Omacgene公司的DMEM培養基培養，K562細胞采用Hyclones公司的RPMI1640培養基培養）；大腸桿菌Trans10購自北京全式金生物技術有限公司；質粒pLVX-EF1α-IRES-Puro購自優寶生物公司；CD19截短體對應的核苷酸序列由金斯瑞公司合成，以pUC57的質粒形式提供；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自天根公司；限制性內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ購自NEB公司；LipofectAMINE LTX&Plus Reagent、嘌呤霉素、抗CD19-N端抗體、抗GAPDH抗體和二抗均購自Invitrogen 公司；Human IL-2 ELISA kitⅡ購自 BD公司。

1.2 CD19截短體慢病毒表達載體的構建

設計的CD19t不包含胞內段編碼基因，全長1029 bp。前后分別是EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位點，中間由66 bp的信號肽序列、27 bp的HA標簽、915 bp的胞外段與跨膜區對應序列和終止密碼子組成（圖1）。由金斯瑞公司合成，以pUC57質粒形式提供。用EcoRⅠ/BamHⅠ酶切得到目的片段，膠回收后連入pLVX-EF1α-IRES-Puro載體的EcoRⅠ/BamHⅠ位點，構建得到pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表達載體（圖2）。

圖1 CD19蛋白截短體CD19t序列設計示意圖

1.3 病毒包裝、感染

293FT細胞按1×106/孔接種于 6孔板，37℃、5%CO2條件下培養，次日將目的慢病毒載體與包裝質粒D8.9、VSVG-L用脂質體LipofectAMINE LTX&Plus Reagent共轉染293FT細胞，6 h后換液，于24、48、72 h收取上清，用4.5 μm濾器過濾，將K562細胞按1×104/孔接種于24孔板，每孔加入1 mL RPMI1640培養基、1 mL病毒上清和1.5 μL聚凝胺，3 d后用嘌呤霉素（0.5 μg/mL）篩選4～5 d，獲得目的細胞株K562/CD19t。

圖2 pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表達載體構建示意圖

1.4 Western印跡檢測細胞CD19t蛋白的表達

取1×105K562/CD19t細胞，1000 r/min離心3 min，PBS洗2次，棄去PBS，于冰上加RIPA，冰上孵育振蕩，30 min后12 000 r/min離心20 min，棄沉淀，上清分裝備用。取上清2.5 μL，蛋白定量得其濃度。配膠，加樣，電泳（電泳分離膠濃度為15%，濃縮膠和分離膠分別用100 V/20 min、160 V/1 h）；轉膜時設定100 V，1 h，并用5%的牛血清白蛋白（BSA）封閉；孵育蛋白一抗，4℃翻轉過夜，TBST洗3次；孵育蛋白二抗，1 h，TBST洗3次；與發光液和穩定劑避光孵育2 min，于暗室中顯影、定影。

1.5 免疫熒光檢測細胞CD19t蛋白的表達

取5×104目的細胞，400 r/min離心 5 min，甩片后用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，10 min/次；5%BSA室溫封閉1 h，棄去封閉液，加入抗CD19-N端抗體（1∶50稀釋），4℃過夜；PBS洗3次，10 min/次，加入熒光標記二抗（1∶200稀釋），室溫孵育 40 min，PBS洗 3次，10 min/次；用含DAPI的封片劑封片保存，熒光顯微鏡觀察。

1.6 檢測K562/CD19t與嵌合抗原受體Jurkat細胞共培養上清中IL-2的表達

取2×104K562/CD19t細胞和 1×104識別 CD19的CAR-Jurkat細胞，于48孔板中共培養過夜，12 h后取上清，1500 r/min離心3 min，棄沉淀，上清分裝備用。用BD公司的Human IL-2 ELISA KitⅡ試劑盒檢測上清中IL-2的濃度。

2 結果

2.1 pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表達載體的構建

將含有CD19t基因的質粒pUC57-CD19t用EcoRⅠ/BamHⅠ酶切，目的片段連入經相同酶切的pLVX-EF1α-IRES-Puro載體，隨機選取2個克隆，分別用EcoRⅠ/BamHⅠ和XhoⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定，DNA電泳片段和模式與預期相符（圖3），序列測定顯示插入序列正確無誤（結果未示），證明pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro表達載體構建成功。

圖3 質粒pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro的雙酶切產物電泳圖譜

2.2 Western印跡檢測轉染后K562細胞中CD19t的表達

以轉染空載體的K562為對照組，轉染pLVXEF1α-CD19t-IRES-Puro載體的 K562/CD19t為實驗組，并以GAPDH為內參。結果顯示，實驗組表達CD19t而對照組，差異明顯（圖4）。

2.3 免疫熒光檢測轉染后K562細胞中CD19t的表達

CD19t具有跨膜區，理論上會表達于細胞膜表面。因此，我們檢測了CD19t在目的細胞K562/CD19t中的表達定位。如圖5所示，CD19t（綠色）高度表達于K562/CD19t的細胞膜處，而轉染空載體的K562/NC則不表達。

圖4 Western印跡檢測CD19t蛋白在K562細胞中的表達

圖5 CD19t蛋白表達于K562細胞膜上（熒光顯微鏡，×400）

2.4 ELISA檢測K562/CD19t和CAR-Jurkat共培養上清中IL-2的表達量

根據設計，截短體CD19t的胞外區會發揮與CD19胞外區類似的功能。將轉染CD19t和轉染空載體的K562細胞分別與識別CD19的CAR-Jur?kat共培養，取上清檢測IL-2濃度。如圖6所示，實驗組與對照組的細胞因子IL-2濃度差異顯著，提示K562/CD19t表達的CD19t能夠被識別CD19的CAR-Jurkat有效識別，并能刺激CAR-Jurkat細胞分泌IL-2。

圖6 ELISA檢測K562/CD19t和CAR-Jurkat細胞共培養上清中IL-2的濃度

3 討論

CD19分子主要表達于B細胞表面，調節B細胞相關信號的轉導，在臨床診斷和治療方面也具有重要意義。幾乎所有B細胞來源的惡性腫瘤細胞均表達CD19，因此以CD19為靶標的免疫治療方法具有相當程度的治療效果。

這些免疫治療方法主要有兩類：一類是抗CD19分子的單克隆抗體的應用，一類是嵌合抗原受體CART-CD19細胞療法。前者主要有非結合抗體、藥物共軛抗體和雙特異性抗體。其中，一種針對急性淋巴白血病的雙特異性抗體藥物Blinatumomab在36例患者的研究中，除2人外均達到了緩解。后者，CART-CD19細胞療法是迄今細胞治療腫瘤領域效果最顯著的方法，與“免疫檢測點抗體阻斷療法”一起被Science雜志評為“2013年十大科學突破之首”[12]。

我們所構建的CD19截短體僅表達CD19分子的胞外區和跨膜區，為研究某些功能區域提供了如下便利：①CD19t基因的長度約為CD19全長的一半，能夠提高表達目的基因的慢病毒載體對淋巴細胞的感染效率；②截短體不表達CD19分子的胞內區，可以與表達CD19分子全長或CD19胞內區截短體的細胞系相互比較驗證，研究其胞外區對細胞功能的影響；③將來用截短體K562/CD19t細胞系所構建的小鼠移植瘤模型，既具有CD19抗原性，又避免了CD19分子本身對K562細胞的影響，并且可以為驗證新型結構CART-CD19或靶向CD19的抗體藥物的效能做好準備。

[1]Anderson K C,Park E K,Bates M P,et al.Antigens on human plasma cells identified by monoclonal anti?bodies[J].J Immunol,1983,130(3):1132-1138.

[2]Zhou L J,Ord D C,Omori S A,et al.Structure of the genes encoding the CD19 antigen of human and mouse B lymphocytes[J].Immunogenetics,1992,35(2):102-111.

[3]Haas K M,Tedder T F.Role of the CD19 and CD21/35 receptor complex in innate immunity,host defense and autoimmunity[J].Adv Exp Med Biol,2005,560:125.

[4]Carter R H,Wang Y,Brooks S.Role of CD19 signal transduction in B cell biology[J].Immunol Res,2002,26(1):45-54.

[5]Carter R H,Barrington R A.Signaling by the CD19/CD21 complex on B cells[J].Curr Dir Autoimmun,2004,7:4-32.

[6]Nagro C J D,Otero D C,Anzelon A N,et al.CD 19 function in central and peripheral B-cell develop?ment[J].Immunol Res,2005,31(2):119-131.

[7]Fujimoto M,Poe J C,Inaoki M,et al.CD19 regu?lates B lymphocyte responses to transmembrane signals[J].Semin Immunol,1998,10(4):267-277.

[8]Poe J C,Minardcolin V,Kountikov E I,et al.A c-Mycand surfaceCD19 signalingamplification loop promotes B cell lymphoma development and progres?sion in mice[J].J Immunol,2012,189(5):2318-2325.

[9]Deaglio S,Vaisitti T,Billington R,et al.CD38/CD19:a lipid raft-dependent signaling complex in human B cells[J].Blood,2007,109(12):5390.

[10]師越,王冬梅,廖曉龍.CD19分子的研究進展及臨床應用[J].國際免疫學雜志,2015,38(2):156-160.

[11]James N.Kochenderfer Z Y,Frasheri D,et al.Adop?tive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells[J].Blood,2010,116(19):3875-3886.

[12]賈鶴晉,韓為東.抗CD19嵌合抗原受體修飾的T細胞在血液系統惡性腫瘤中的應用[J].中華血液學雜志,2016,37(2):164-168.

Construction of Lentiviral Expression Vector for CD19 Truncated Protein and its Expression in K562 Cells

ZHANG Zheng-Rong1,2,WANG Man-Na2,LIANG Jian-Qing2,LI Shi-Chong2,HUANG Hong-Yan3,YAN Min1,CHEN Zhao-Lie2,LIU Zhen-Zhen1*,SUN Qiang2*
1.Department of Breast,Cancer Hospital,Zhengzhou University,Zhengzhou 450008;2.Beijing Institute of Bioengi?neering,Beijing 100071;3.Beijing Key Laboratory of Oncology and Oncology Vaccine,Beijing Shijitan Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100038;China

Objective:To construct the lentiviral expression vector pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro for truncated CD19（CD19t） in cytoplasmic region,and examine its expression in K562 cells.Methods:CD19tgene was synthe?sized and cloned into pLVX-EF1α-IRES-Puro vector followed by virus packaging in 293FT cells.Human erythro?leukemia K562 cells were infected with recombinant lentivirus containing CD19t to construct K562/CD19t cells.The expression of CD19t was examined by Western blot and immunofluorescence staining.ELISA was used to ana?lyze the secreted IL-2 in co-culture supernatant of K562/CD19t with CAR-Jurkat.Results:Lentiviral expressionvector pLVX-EF1α-CD19t-IRES-Puro was confirmed by double enzymatic digestion and sequencing.The expres?sion of CD19t in K562 cells was detected by Western blot and immunofluorescence staining.ELISA showed that CAR-Jurkat secreted IL-2,which was stimulated by CD19t expression.Conclusion:The lentiviral vector for CD19t expression has been constructed and CD19t expression can be detected in K562/CD19t cells,which would be helpful to make animal model for B cell leukemia and test CAR-T performance.

CD19;gene cloning;B cells;CAR-T immunotherapy

Q78

A

1009-0002（2017）05-0634-05

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,LIU Zhen-Zhen,E-mail:Liuzhenzhen73@163.com;SUN Qiang,E-mail:sunq@bmi.ac.cn

2017-03-01

國家自然科學基金（81572799，31671432）；國家重點研發計劃（2016YFC1303303）；北京市自然科學基金（7162091）

張崢嶸（1991- ），男，碩士研究生，（E-mail）18703605958@163.com；王嫚娜（1991- ），女，博士研究生；同為第一作者

劉真真，（E-mail）Liuzhenzhen73@163.com；孫強，（E-mail）sunq@bmi.ac.cn