核糖核酸酶A在端粒免疫熒光原位雜交實驗中的應用

于芳，金蕊，黃君健

軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100850

核糖核酸酶A在端粒免疫熒光原位雜交實驗中的應用

于芳，金蕊，黃君健

軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100850

目的：在端粒免疫熒光原位雜交實驗中，降低核仁著色對端粒圖像清晰度的影響。方法：分別將0.1、0.2、0.4 mg/mL的核糖核酸酶（RNase）A與待檢標本于37℃消化過夜，然后進行端粒原位雜交實驗。結果：0.4 mg/mL RNase A可以消除HepG2細胞端粒原位雜交時的非特異結合，使用HeLa、293T和U2OS細胞也有同樣效果。結論：在進行端粒原位雜交實驗時，用0.4 mg/mL RNase A消化核仁可減少探針的非特異結合，提高端粒圖像的清晰度。

核糖核酸酶A；免疫熒光原位雜交（IF-FISH）；端粒

端粒是真核細胞線性染色體末端DNA重復序列（TTAGGG），在維護基因組穩(wěn)定性和細胞生理內穩(wěn)態(tài)中起重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)端粒功能調控與各種疾病的發(fā)生密切相關，因此研究端粒DNA-蛋白質復合物的功能至關重要[2]。在敲低端粒相關蛋白后需要檢測該蛋白的端粒定位情況，實驗中最常用到熒光原位雜交技術（fluores?cencein situhybridization，F(xiàn)ISH）。該技術是20世紀80年代末在放射性原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術[3-4]，基本原理是先把DNA（或RNA）探針用特殊的熒光染料標記，然后將探針直接雜交到染色體上，通過熒光染料發(fā)出的熒光進行DNA序列在染色體上的定位、定性、相對定量分析。我們使用該技術標記細胞中的端粒，在操作過程中，所用探針較短，長度一般為15 bp，且具有良好的穿透性，可用于標記端粒；但同時探針在雜交過程中特異性較弱，會與核仁發(fā)生非特異性結合，即除端粒結合外還有核仁的著色，影響實驗結果。為了消除這種非特異性雜交，我們使用核糖核酸酶（RNase）A消化核仁，減小核仁對探針的影響，得到了較清晰的端粒圖像，為下一步端粒的生物學研究提供了較好的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2、HeLa、293T和U2OS細胞為本實驗室保存；RNase A購于Sigma公司；抗端粒結合蛋白2（TRF2）抗體為Abcam公司產(chǎn)品；紅色熒光標記抗體購自Invitrogen公司；Tel-CAF488FISH探針為BSI公司產(chǎn)品；4%多聚甲醛PBS和其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品；E-80i熒光正置顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品；雜交儀Thermo Brite為Leica公司產(chǎn)品。

1.2 免疫熒光（immunofluorescence，IF）

1.2.1 細胞接種 將消化好的待檢測細胞HepG2用含10%胎牛血清的DMEM混勻后接種到事先放入蓋玻片的12孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，24或48 h后觀察細胞密度，達到70%～80%匯合后取出12孔板，棄DMEM培養(yǎng)液，用1×PBS涮洗1次。

1.2.2 固定 每孔加入600 μL 4%多聚甲醛（PFA），室溫固定10 min，棄固定液，用1×PBS在水平搖床上洗3次，每次5 min。

1.2.3 封閉透化 每孔加入600 μL封閉液，室溫搖床上透化30 min。

1.2.4 一抗結合 按照抗體說明書的要求用封閉液稀釋抗TRF2抗體（一抗），每片蓋玻片加25～30 μL，于37℃恒溫孵育箱中結合1 h或在4℃冰箱中過夜，避光條件下用1×PBS洗片3次，每次5 min。

1.2.5 二抗結合 按照抗體說明書的要求用封閉液稀釋二抗，每片蓋玻片孵25～30 μL稀釋抗體，于37℃恒溫孵育箱中結合1～2 h，避光條件下用1×PBS洗片3次，每次5 min。

1.2.6 染核 用1×PBS按一定比例稀釋DAPI，每孔加入600 μL染核液，避光染核5 min，熒光顯微鏡下觀察染色情況，并拍照保存。

1.3 熒光原位雜交

1.3.1 RNase A消化核仁 將附著細胞的玻片放在分別含有 0.1、0.2、0.4 mg/mL RNase A 的 PBS液體中，37℃孵育過夜。

1.3.2 再固定 用4%PFA固定10 min，避光條件下用1×PBS洗蓋玻片3次，每次5 min。

1.3.3 脫水處理 依次用75%、95%的乙醇和無水乙醇避光脫水處理5 min，室溫避光干燥15 min，使其充分干燥。

1.3.4 雜交液配制 用商品化TELEAF488綠色熒光探針，稀釋液含2%BSA、10 mmol/L Tris-Cl（pH7.2）、70%甲酰胺，探針按1∶100稀釋使用。每個蓋玻片孵育15～20 μL含100 nmol/L探針的雜交液，再用膠水將蓋玻片的四周封閉保濕。

1.3.5 雜交儀工作設置 80℃變性處理10 min，37℃雜交2 h，再4℃過夜處理。

1.3.6 洗片 避光條件下用1×PBS洗片3次，每次5 min。

1.3.7 細胞核染色 用1×PBS按照一定比例稀釋DAPI，每孔加入600 μL染核液，避光染核5 min，熒光顯微鏡下觀察染色定位情況，并拍照保存。

1.4 對比實驗

在做FISH之前將玻片分別泡在含0.1、0.2、0.4 mg/mL RNase A的PBS溶液中，于37℃充分消化過夜，之后用4%多聚甲醛固定，脫水雜交處理，與不加RNase A的樣品對比，觀察樣品經(jīng)RNase A消化后對端粒雜交效果的影響，核仁有無雜交信號。

同時對HeLa、293T和U2OS細胞系經(jīng)0.4 mg/mL RNase A處理后的端粒FISH結果進行分析，觀察端粒雜交效果。

2 結果

端粒蛋白復合體（shelterin）在維持基因組穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，我們用HepG2細胞研究復合體蛋白TRF2在端粒中的定位時，發(fā)現(xiàn)IF-FISH實驗結果中端粒的圖像總是受核仁染色的影響，甚至影響了端粒foci的形成，干擾實驗結果分析。核仁的主要成分是細胞核RNA，因此我們試想用RNase A對核仁進行消化，以減少核仁對實驗的影響。我們選取了3個濃度的RNase A，在IF反應結束后將細胞放在含RNase A的PBS中于37℃過夜，然后再進行FISH，之后分別檢測端粒染色情況和待測蛋白的定位情況。在不加RNase A的端粒免疫熒光圖片中（圖1），細胞核內的核仁非常明顯，加了0.1和0.2 mg/mL RNase A的細胞核內的核仁有所減弱，但還不能完全消除；在使用0.4 mg/mL RNase A消化后，核仁基本沒有著色。初步說明IF后加入0.4 mg/mL RNase A可有效降低細胞核中RNA的干擾，獲得較清晰的端粒圖像，為下一步實驗提供可靠的數(shù)據(jù)。

為了證實這種方法的可行性，我們同時選取了另外3種細胞系來研究RNase A對端粒FISH的影響，結果見圖2，可見不同細胞系經(jīng)0.4 mg/mL RNase A處理后均能得到較清晰的端粒圖像，證明此方法是可行的。

圖1 HepG2細胞經(jīng)RNase A消化前后熒光原位雜交效果對比

圖2 不同細胞系端粒原位雜交結果

3 討論

相關研究表明端粒的主要生物學功能是保護染色體末端，避免染色體末端的降解和端-端融合，對維持基因組結構的完整性和穩(wěn)定性也起到至關重要的作用。免疫熒光及熒光原位雜交技術在實驗室多項研究中廣泛應用[5]，是研究核蛋白定位的手段。我們在探討端粒相關蛋白的功能時需要檢測端粒蛋白的定位情況，但實驗結果總會受核仁的影響，不能得到清晰的端粒原位雜交位點圖像。在腫瘤細胞中，蛋白質合成旺盛，核仁較大，而核仁是真核細胞間期核中最明顯的結構，所有真核生物的核糖體RNA（rRNA）的轉錄都是在核仁中完成的。又由于端粒探針的長度較短，在做端粒原位雜交實驗時，端粒探針在對端粒進行雜交的同時會與核仁中的RNA有不同程度的結合，進而干擾細胞端粒染色效率。由于待檢測目標蛋白表達較強，不會受探針雜交影響，因此我們在目標蛋白免疫熒光反應之后、雜交之前用0.4 mg/mL的RNase A于37℃對不同細胞系進行消化過夜，然后再進行雜交，有效地解決了核仁對實驗結果的影響，同時并不影響目標蛋白的結合。在正常細胞中此方法也得到了驗證。綜上，在端粒FISH實驗中加入一定濃度的RNase A可以提高端粒免疫熒光的特異性，得到清晰的端粒FISH圖像。

[1]Marsh T C Vesenka J,Henderson E.A new DNA na?no-structure,the G-wire,imaged by scanning probe microscopy[J].Nucleic Acids Res,1995,23(4):696-700.

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Application of RNase A in Telomere IF-FISH Experiment

YU Fang,JIN Rui,HUANG Jun-Jian*
Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850,China

Objective:To decrease nucleolus coloring in immunofluorescence-fluorescencein situhybridization（IF-FISH） of telomere.Methods:The cells were digested overnight at 37℃ with RNase A at concentration of 0.1,0.2 and 0.4 mg/mL and subjected to telomerein situhybridization.Results:The use of 0.4 mg/mL RNase A eliminates nonspecific binding of HepG2 telomerein situhybridization and ensure the accuracy of the experimen?tal results.The same results were also got in HeLa,293T and U2OS cells.Conclusion:In situhybridization of telomere,digesting nucleoli with RNase A can provide a clearer immunofluorescence imaging and specificity.

RNase A;immunofluorescence-fluorescencein situhybridization（IF-FISH）;telomere

Q78

A

1009-0002（2017）05-0681-04

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:junjianhuangbit@163.com

2017-05-03

于芳（1972- ），女，碩士，實驗師，（E-mail）yuf_2013@126.com

黃君健，（E-mail）junjianhuangbit@163.com