實時定量PCR檢測新生兒全血中肺炎克雷伯菌方法的建立和應用

章晟，莊璐，李秋平，宋婕，張玉佩，朱麗敏，趙丹華，王瑞娟，封志純

陸軍總醫院 附屬八一兒童醫院；出生缺陷防控關鍵技術國家工程實驗室；兒童器官功能衰竭北京市重點實驗室；北京 100007

實時定量PCR檢測新生兒全血中肺炎克雷伯菌方法的建立和應用

章晟，莊璐，李秋平，宋婕，張玉佩，朱麗敏，趙丹華，王瑞娟，封志純

陸軍總醫院 附屬八一兒童醫院；出生缺陷防控關鍵技術國家工程實驗室；兒童器官功能衰竭北京市重點實驗室；北京 100007

目的：建立實時定量PCR（RQ-PCR）快速檢測新生兒血液標本中肺炎克雷伯菌基因組DNA的方法，并進行初步臨床應用。方法：選擇肺炎克雷伯菌高度保守的二鳥苷酸環化酶基因作為靶基因，設計特異性引物和TaqMan探針，建立RQ-PCR反應體系；采用含靶基因擴增片段的重組質粒建立標準曲線，提取血液中的基因組DNA，對500份新生兒血液標本進行RQ-PCR檢測。結果：設計的引物和探針特異性高，檢測限為1個拷貝數；500份新生兒血液標本中，RQ-PCR檢測為陽性的有18個病例，陽性率為3.6%，明顯高于血培養的陽性率2.4%（12個病例），差異具有統計學意義（P＜0.01）。結論：RQ-PCR可用于檢測新生兒血液標本中的肺炎克雷伯菌，此方法快速、靈敏、特異性強。

實時定量PCR；新生兒；肺炎克雷伯菌；血標本

新生兒重癥監護病房收治出生小于28 d的新生兒，包括（極）早產兒、極（超）低出生體質量兒、足月重癥新生兒等病情嚴重的患兒，新生兒本身剛脫離子宮內環境驟然轉變至宮外，對外界適應性差，自身免疫系統不夠完善，加上患兒病情較重、住院時間長，并且經常進行侵入性操作，極易并發院內感染，往往導致患兒病情加重，甚至是死亡[1-3]。在新生兒重癥監護病房中血液感染是最主要的感染途徑，而肺炎克雷伯菌占到很高的比例[4-6]，因此快速檢測出血液中的肺炎克雷伯菌，對于指導臨床抗感染治療具有重要意義。隨著分子生物學技術的快速發展，實時定量PCR（RQ-PCR）技術在細菌、病毒的快速檢測方面得到廣泛應用[7-8]。基于此，我們研究建立了能夠快速、高效地檢測新生兒全血中肺炎克雷伯菌基因組DNA的RQ-PCR方法，可為新生兒感染的早期診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

肺炎克雷伯菌（NCTC 5056）及其他常見病原菌［大腸埃希菌（NCTC 10538）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29123）、表皮葡萄球菌（ATCC 12228）、溶血葡萄球菌（X03）、單核增生李斯特菌（ATCC 19115）、鮑曼不動桿菌（ATCC 19606）、銅綠假單胞菌（ATCC 9027）、屎腸球菌（ATCC 6057）］均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。大腸埃希菌以LB培養基培養，肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌以營養肉汁瓊脂培養，單核增生李斯特菌、屎腸球菌以PYG培養基培養。

細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；質粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒（Omega Bio-Tek公司）；QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen公司）；pMD 19-T載體、Ex Taq DNA聚合酶、Premix Ex Taq（Probe qPCR）（大連寶生物工程有限公司）；ABI 7500熒光實時定量PCR儀（ABI公司）；引物和探針由Invitrogen公司合成。

1.2 特異性引物及TaqMan探針設計

依據GenBank收錄的肺炎克雷伯菌二鳥苷酸環化酶（diguanylate cyclase）基因全序列（NC_023333.1）。將二鳥苷酸環化酶基因序列在Gen?Bank基因庫中進行比對，結果顯示其具有良好的種間特異性。參照TaqMan探針和引物設計原則，將RQ-PCR反應的引物（上游引物：GCAGATAAT TCACGCCCAGC；下游引物：CCCGCTGGACGCCA TC；擴增片段長113 bp）和探針（FAM-CCACCAC GCTCATCTGTTTCGCC-BHQ1）選取在二鳥苷酸環化酶基因的保守區，并將PCR擴增序列同樣在基因數據庫中進行比對，結果顯示引物和探針具有良好的特異性。

1.3 細菌基因組DNA提取

采用天根公司的細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、單核增生李斯特菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、屎腸球菌的基因組DNA，其中革蘭陽性細菌（金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、單核增生李斯特菌、屎腸球菌）先用溶菌酶處理4 h后再進行提取。

1.4 引物有效性及特異性驗證

以提取的細菌基因組DNA及健康人基因組DNA 為模板進行 PCR，反應體系為 50 μL（10×PCR 緩沖 液 5 μL，10 μmol/L 上、下游引物 各1.25 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，5 U/μL Ex Taq DNA 多聚酶 0.2 μL，模板 DNA 2 μL，滅菌去離子水 39.3 μL）。反應條件：94℃ 3 min；94℃ 60 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個 循 環 ；72℃ 5 min。PCR反應結束后，經瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 探針有效性及特異性驗證

以提取的細菌基因組DNA及健康人基因組DNA為模板進行RQ-PCR，反應體系為20 μL（Premix Ex Taq 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各 0.5 μL，0.2 μmol/L TaqMan 探針 1 μL，模板DNA 5 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.2 μL，滅菌去離子水2.8 μL）。采用ABI 7500熒光定量PCR儀進行檢測。反應條件：95℃ 2 min；95℃ 5 s，60℃ 40 min，40個循環。

1.6 重組質粒標準品的構建及提取

以肺炎克雷伯菌基因組為模板進行普通PCR，擴增產物用凝膠回收試劑盒純化，純化后的DNA片段與pMD 19-T載體連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，進行藍白斑篩選，挑選白色的單克隆菌落增菌培養、測序，測序結果經比對與靶基因片段序列一致后再次增菌培養，用質粒小量提取試劑盒提取重組質粒pMD 19-T/KP，用紫外分光光度計測定重組質粒的純度（D260nm/D280nm）及濃度。根據pMD 19-T/KP質粒在溶液中的濃度與拷貝數換算方法，按1D=2.65×1010拷貝/μL，計算所提取質粒DNA的單位拷貝數，分裝后于-70℃保存。

1.7 靈敏度檢測

取106～100拷貝/μL連續濃度梯度的標準品作為模板，每個反應體系中加入1 μL模板，即每個反應檢測的拷貝數為106～100拷貝，同時設立滅菌去離子水和健康人全血基因組2種陰性對照，選定標準曲線任務進行RQ-PCR反應，反應結束后用SDS軟件自動繪制標準曲線，根據相關系數、擴增效率等參數，確定標準曲線范圍，以上實驗經多次重復，驗證其準確性。

1.8 RQ-PCR檢測血液中肺炎克雷伯菌預實驗

在 200 μL 健康人全血中分別加如 105、103、10 cfu的肺炎克雷伯菌，模擬感染肺炎克雷伯菌的全血標本。用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取全血標本基因組DNA，通過RQ-PCR反應檢測肺炎克雷伯菌的基因組DNA，每個反應中加入模板5 μL。以上實驗重復3次，以驗證其準確性。

1.9 RQ-PCR檢測臨床標本中的肺炎克雷伯菌

對500份取自本院新生兒監護病房的疑似感染的全血標本進行肺炎克雷伯菌基因組DNA檢測，方法同前，每個RQ-PCR反應中加入模板5 μL，陽性結果的樣本復檢1次，復檢一致的樣本，根據標準曲線推算樣本拷貝數。對RQ-PCR結果與同時采集的血培養、常規培養鑒定結果進行平行比較，其中常規鑒定方法使用VITEK-2全自動微生物分析系統。

1.10 統計分析

所收集的數據采用SPSS 20.0軟件進行分析處理，統計學差異分析采用Fisher精確檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 引物特異性檢測

經過瓊脂糖電泳檢測，僅在肺炎克雷伯菌泳道的110 bp處可見目標條帶，其余各泳道未見擴增條帶（圖1），說明PCR引物只能特異性地擴增肺炎克雷伯菌的基因組DNA。

圖1 肺炎克雷伯菌引物PCR擴增產物電泳圖

2.2 探針特異性檢測

以9種細菌基因組DNA、人基因組DNA為模板進行RQ-PCR，結果只有加入肺炎克雷伯菌基因組DNA的反應孔中才有熒光信號出現，其他各反應孔均無熒光信號（圖2），說明引物和探針能特異性地檢測肺炎克雷伯菌基因組DNA。

圖2 肺炎克雷伯菌RT-PCR特異性檢測結果

2.3 重組質粒的構建及測序

將篩選的質粒pMD 19-T/KP測序結果與GenBank所收錄的序列進行比對，結果顯示pMD 19-T/KP插入序列與靶基因序列一致（圖3）。

圖3 pMD 19-T/KP插入序列色譜圖

2.4 靈敏度檢測

多次RQ-PCR結果顯示，106～100拷貝的pMD 19-T/KP質粒均能被檢測到，Ct值隨拷貝數的減少而遞增，且曲線基本符合線性關系，而以滅菌去離子水和健康人全血基因組為模板的陰性對照未檢測到熒光信號，因此RQ-PCR檢測肺炎克雷伯菌基因組DNA的最低檢測限為1個拷貝數（圖4）。

圖4 肺炎克雷伯菌RT-PCR靈敏度檢測結果

2.5 RQ-PCR檢測血液中肺炎克雷伯菌預實驗

將模擬感染肺炎克雷伯菌的全血標本提取基因組DNA，通過RQ-PCR檢測，加入不同濃度肺炎克雷伯菌的標本均能檢測到熒光信號，且Ct值隨濃度的減少而遞增，而提取健康人的全血標本基因組DNA為模板的反應中未檢測到熒光信號（圖5）。多次實驗結果均一致。

2.6 RQ-PCR檢測臨床標本中的肺炎克雷伯菌

采用RQ-PCR對500份疑似感染的全血標本進行肺炎克雷伯菌基因組DNA檢測，檢出陽性標本18份，通過公式推算，檢測到的拷貝數為2～89；常規培養鑒定結果為陽性的標本有12份。500份標本中，2種方法鑒定均為陽性的10份，RQ-PCR結果為陽性、常規培養鑒定為陰性的標本有8份，RQ-PCR結果為陰性、常規培養鑒定為陽性的標本有2份，2種方法鑒定均為陰性的標本有480份。因為有理論頻數小于1，所以采用Fisher精確檢驗進行統計學分析，P=0.000＜0.05，2種檢測方法結果之間存在統計學差異（表1）。

圖5 RT-PCR檢測血液中肺炎克雷伯菌預實驗結果

表1 RT-PCR與常規培養鑒定檢測結果比較

3 討論

近年來隨著圍產醫學，尤其是新生兒重癥監護病房（NICU）的快速發展，危重新生兒的存活率不斷提高。但是由于新生兒的免疫功能低下、住院時間長、侵入性操作多、廣譜抗生素廣泛應用，導致NICU中感染發生率較高，其中肺炎克雷伯菌的感染發生率不斷提高，已成為NICU院內感染的主要菌株之一。肺炎克雷伯菌侵入新生兒血液后，如果不能得到及時的治療，極易導致新生兒敗血癥的發生，可迅速出現多臟器功能衰竭，并發休克，病死率高，嚴重威脅新生兒的生命健康[9-10]。

細菌培養鑒定是目前檢測肺炎克雷伯菌的最常用方法，一般需要經過培養、分離、生化反應或質譜鑒定等步驟，雖然目前已有多種半自動或全自動微生物培養、鑒定系統，但整個過程至少需要48 h，耗時耗力，而且細菌檢出陽性率不高。但是新生兒病情發展快，如何快速鑒定病原菌，對于臨床治療具有重要意義。核酸檢測是目前細菌快速檢測的發展方向，它不需要進行細菌培養，而是直接檢測樣本中的細菌基因組DNA，可大大縮短檢測時間；并且不再局限于細菌形態結構及生理特性，具有較高的準確性[11]。目前細菌核酸檢測方法包括普通PCR檢測[12]、實時熒光PCR檢測[13]、基因芯片檢測[14]、基因組測序[15]。普通PCR檢測準確度不夠、特異性差，而基因芯片檢測和基因組測序技術要求高、檢測成本高。相比較而言，實時熒光PCR檢測具有較高的敏感性、特異性和穩定性，更適合醫院開展臨床細菌檢測工作。此外，實時熒光PCR檢測全血標本時需要的全血量較少，200～500 μL 即可，而普通血培養需要3～5 mL，針對新生兒體重輕、血量少的特點，減少采血量更有意義[16]。

本研究根據肺炎克雷伯菌二鳥苷酸環化酶基因的保守序列設計了特異性引物和探針，在RQ-PCR反應中，加入肺炎克雷伯菌基因組DNA的反應孔能檢測到熒光信號，而加入其他幾種常見病原菌基因組DNA的反應孔中均無熒光信號，說明引物和探針具有較高的特異性。用克隆到pMD 19-T載體上的二鳥苷酸環化酶基因DNA片段作為標準DNA模板建立標準曲線，多次結果顯示本方法的Ct值與質粒拷貝數呈線性相關，最低檢測限為1個拷貝，說明引物和探針具有較高的敏感性和穩定性。

對500例臨床標本進行RQ-PCR檢測，陽性率為3.6%，而常規培養鑒定方法的陽性率為2.4%，通過統計學計算，2種方法檢測結果之間存在統計學差異，說明RQ-PCR的靈敏度優于常規培養鑒定方法。有8個標本RQ-PCR結果為陽性而常規培養鑒定未檢出，可能的原因是：①菌體量較少會導致無法培養出細菌；②經過抗生素治療后，血液內還殘留有較少的死菌，可以通過RQ-PCR檢測出來，但無法培養；③由于污染導致出現假陽性。有2個標本常規培養鑒定結果為陽性而RQ-PCR結果為陰性，可能的原因是：①提取過程中細菌基因組DNA未結合到吸附柱上，導致細菌基因組DNA丟失；②提取的細菌基因組DNA溶液中混有血紅蛋白等雜質，抑制RQ-PCR的反應；③常規培養過程中由于污染導致結果出現假陽性。

綜上所述，我們建立的檢測血液中肺炎克雷伯菌細菌基因組DNA的RQ-PCR方法，具有快速、靈敏度高、特異性強等優勢，檢測時間比常規細菌鑒定方法縮短48～72 h，檢測靈敏度高于常規細菌培養結果。血液培養、常規培養鑒定是血液感染檢測最為重要的金標準，而RQ-PCR檢測方法可以作為有益補充，尤其是重癥新生兒病情變化快，RQ-PCR能夠快速得到檢測結果，對于臨床診斷、治療具有重要參考價值。

[1]耿慶紅,文海燕,郭瑞霞.NICU患兒感染病原菌分布及藥敏試驗分析[J]．中華醫院感染學雜志,2015,25(6):1276-1280.

[2]鐘巧,李暉,高曉玲,等.NICU早產與足月新生兒敗血癥特點對比研究[J]．中華醫院感染學雜志,2014,24(1):211-213.

[3]Blencowe H,Vos T,Lee A C,et al.Estimates of neo?natal morbidities and disabilities at regional and glob?allevels for2010:introduction,methods overview,and relevant findings from the Global Burden of Dis?ease study[J].Pediatr Res,2013,74(Suppl 1):4-16.

[4]許亞茹,關毅,王淑娟,等．NICU醫院感染病院菌傳播途徑與預防控制研究[J]．中華醫院感染學雜志,2014,24(13):3167-3171.

[5]王兆莉,謝建寧,戴怡蘅,等.新生兒醫院感染敗血癥臨床分析[J].中華醫院感染學雜志,2014,24(21):5390-5392.

[6]邵波,胡小紅,陸國平,等.NICU早產兒肺炎克雷伯菌醫院感染臨床分析[J].中華醫院感染學雜志,2014,24(19):4882-4884.

[7]Duffy T,Cura C I,Ramirez J C,et al.Analytical per?formance of a multiplex real-time PCR assay using TaqMan probes for quantification of Trypanosoma cru-zi satellite DNA in blood samples[J].PLoS Negl Trop Dis,2013,7(1):e2000-2010.

[8]Yang S,Lin S,Kelen G D,et al.Quantitative multi?probe PCR assay for simultaneous detection and identi?fication to species level of bacterial pathogens[J].J Clin Microbiol,2002,40(9):3449-3454.

[9]呂媛,任靜,繆珀,等.新生兒肺炎克雷伯菌敗血癥臨床分析[J].中國新生兒科雜志,2013,28(2):76-79.

[10]劉曉翠,元小冬,許亞茹,等.NICU患者感染肺炎克雷伯菌與耐藥性研究[J].中華醫院感染學雜志,2015,25(22):5066-5068.

[11]孫長貴,成軍.分子診斷技術在臨床微生物學檢驗中的應用[J].中華檢驗醫學雜志,2013,36(2):109-112.

[12]Muyzer G,Waal E D,Uitterlinded A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reac?tion-amplified genes coding for 16S rRNA[J].Appl En?viron Microbiol,1993,59(3):695-700.

[13]Tuomisto S,Karhunen P J,Vuento R,et al.Evalua?tion of postmortem bacterial migration using culturing and real-time quantitative PCR[J].J Forensic Sci,2013,58(4):910-916.

[14]Mancini N,Infurnari L,Ghidoli N,et al.Potential im?pact of a microarray-based nucleic acid assay for rap?id detection of gram-negative bacteria and resistance markers in positive blood cultures[J].J Clin Microbi?ol,2014,52(4):1242-1245.

[15]Hasman H,Saputra D,Sicheritz-Ponten T,et al.Rap?id whole-genome sequencing for detection and charac?terization of microorganisms directly from clinical sam?ples[J].J Clin Microbiol,2014,52(1):139-146.

[16]Pusterla N,Mapes S,Byrne B A,et al.Detection of bloodstream infection in neonatal foals with suspected sepsis using real-time PCR[J].Vet Rec,2009,165(4):

Establishment and Application of TaqMan Real-Time PCR for Detection ofKlebsiella pneumoniaein Neonatal Blood Sample

ZHANG Sheng,ZHUANG Lu,LI Qiu-Ping,SONG Jie,ZHANG Yu-Pei,ZHU Li-Min,ZHAO Dan-Hua,WANG Rui-Juan,FENG Zhi-Chun*
Affiliated Bayi Children's Hospital,Chinese People's Liberation Army General Hospital;National Engineering Labo?ratory for Birth Defects Prevention and Control of Key Technology;Beijing Key Laboratory of Pediatric Organ Fail?ure;Beijing 100007,China

Objective:To establish a real-time quantitative PCR（RQ-PCR） assay for detectingKlebsiella pneu?moniaegenomic DNA from neonatal blood sample,and preliminarily apply it in clinical test.Methods:The prim?ers and TaqMan probe were designed targeting the highly conserved diguanylate cyclase gene ofK.pneumoniae,and a amplification reaction system was established.The standard curve was built based on the recombinant plas?mid DNA containing the amplification of the target gene.The genomic DNA was extracted using QIAamp DNA Blood Mini Kit from five hundred neonatal blood sample,followed by RQ-PCR detection.Results:The specificity of primers and probe were high,the detecting limit was 1 copy.For five hundred neonatal blood sample,the posi?tive rate of RQ-PCR was 3.6%（18 patients）,which was significantly higher than 2.4%（12 patients） by blood cul?ture.Conclusion:RQ-PCR assays is a rapid,sensitive,and specific method and can be used in the detection ofK.pneumoniaein neonatal blood samples.

real-time quantitative PCR;neonate;Klebsiella pneumoniae;blood sample

Q78

A

1009-0002（2017）05-0665-06

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:fengzc81@sina.com

2017-03-01

中國博士后科學基金（2013M542472）

章晟（1980- ），男，副主任技師，（E-mail）ahswzs@sina.com

封志純，（E-mail）fengzc81@sina.com