重組人胸腺素β4生物學活性測定方法的建立

徐宏偉，張俊英，馬杉姍，湯曉闖，馬素永，2，聶李亞，2，許松山，2

1.北京諾思蘭德生物技術股份有限公司，北京 100085；2.北京市裸質粒基因治療藥物工程技術研究中心，北京 100085

技術方法

重組人胸腺素β4生物學活性測定方法的建立

徐宏偉1，張俊英1，馬杉姍1，湯曉闖1，馬素永1，2，聶李亞1，2，許松山1，2

1.北京諾思蘭德生物技術股份有限公司，北京 100085；2.北京市裸質粒基因治療藥物工程技術研究中心，北京 100085

目的：建立適用于重組人胸腺素β4（rhTβ4）體外質量控制的生物學活性測定方法，用于該制品的生物學活性評價。方法：利用ECV304細胞遷移法，摸索細胞密度、玻連蛋白（Vn）濃度、rhTβ4濃度等影響因素，并對試驗條件進行優化及方法驗證。結果：細胞密度為0.5×104/孔、Vn濃度為12.5 μg/mL、rhTβ4濃度為200 nmol/L、孵育時間24 h和細胞遷移時間4 h時，細胞遷移率較高。結論：建立了rhTβ4生物學活性測定方法，該方法專屬性強、重復性好、準確性高，可用于rhTβ4生物學活性測定。

重組人胸腺素β4；活性檢測；細胞遷移

胸腺素β4（thymosin β4，Tβ4）是一種在多種組織均有表達的多肽，廣泛分布于各組織、器官和細胞中，作為哺乳動物細胞內一種主要的肌動蛋白調節分子，對受損組織的再生、重塑和愈合起重要作用[1-2]。研究表明，Tβ4具有多方面生物學活性，能夠促進創傷區域表皮的細胞遷移、血管的生成和膠原沉積，具有消炎和促進創傷愈合的功效，在治療皮膚、角膜創傷，心肌梗死，抗腫瘤等方面有著廣闊的應用前景[3-5]。

目前Tβ4的制備方法有化學合成和基因工程兩種，化學合成方法成本較高，而利用基因工程技術獲得重組人Tβ4（recombinant human Tβ4，rhTβ4），并將其開發成為治療用生物制品Ⅰ類新藥，具有成本低、技術成熟、可大量生產等優勢。

由于沒有已上市品種的參照，因此需要從頭建立rhTβ4的質量標準。作為質量標準中的重要指標，生物學活性檢測方法的建立和優化尤為必要。文獻報道的Tβ4活性檢測方法多種多樣：Tβ 4可促進多種細胞（如臍靜脈血管內皮細胞、角膜上皮細胞及皮膚角化細胞）遷移；Tβ4具有促進血管生成的作用，可在E-玫瑰花結實驗中觀察其免疫活性[6-8]。本實驗室在表達rhTβ4的基礎上，建立、優化并驗證了采用臍靜脈血管內皮細胞測定rhTβ4生物學活性的方法，為rhTβ4的進一步藥用開發奠定了堅實的基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

臍靜脈血管內皮細胞ECV304和rhTβ4供試品由北京諾思蘭德生物技術股份有限公司保存或制備。DMEM培養基（Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青工程材料有限公司）；玻連蛋白（vit?ronectin，Vn）（Gibco公司）；MTT（Sigma公司）；Transwell（孔徑 8 μm）（Corning公司）。

1.2 細胞培養

采用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養ECV304細胞，接種密度為1×104/孔，24 h后將培養液替換為不含胎牛血清的DMEM培養基進行饑餓培養過夜。棄掉培養液，加入新鮮的含5%胎牛血清和160 nmol/L rhTβ4的DMEM培養基培養24 h。

1.3 細胞遷移

用100 μg/mL Vn溶液包被24孔細胞遷移板并孵育2 h，棄上清，加入同體積的含0.5%牛血清白蛋白（BSA）的DMEM培養基，再用含0.1%BSA的DMEM培養基調整至適宜的細胞密度，將細胞加入Transwell的上室培養4 h。用95%甲醇/5%PBS固定5 min，然后擦除遷移孔內膜表面未遷移的細胞，染色5 min，漂洗干凈。以細胞遷移指數（實驗組遷移細胞數與對照組遷移細胞數的比值）來判定本品對細胞遷移的作用，選用光學顯微鏡低倍物鏡（×4）選取細胞分布均勻的視野區域，再在20倍物鏡下用目鏡中附加的網格隨機挑選5個視野（鐘表圓心和3、6、9、12點位置）進行拍照，用IPP軟件統計遷移細胞，取其平均值為該孔的計數結果。

1.4 細胞遷移中重要影響因素的篩選

對細胞密度、Vn濃度和rhTβ4濃度在細胞遷移中的影響進行篩選。分別設定細胞密度為5×104、1×104和 0.5×104/孔，Vn 濃度為 25、50 和 100 μg/mL，rhTβ4濃度為0、1.6、16和160 nmol/L，根據上述細胞遷移方法進行篩選。

1.5 細胞遷移試驗條件的優化

采用L9（33）正交試驗設計進行細胞遷移試驗條件的優化，主要影響因素包括細胞密度、rhTβ4濃度和Vn濃度，每個因素分為3個水平，具體試驗條件見表1。

表1 L9（33）正交試驗因素水平表

1.6 專屬性測定

根據前期實驗結果，設定實驗條件為細胞密度 0.5×104/孔、rhTβ4濃度 200 nmol/L、Vn濃度12.5 μg/mL、rhTβ4孵育時間24 h、細胞遷移時間4 h，進行方法學驗證實驗。考察成品輔料對rhTβ4活性的干擾，實驗條件設置對照組、供試品組和成品輔料組，分別進行生物學活性測定。

1.7 重復性測定

選用與專屬性測定同樣的試驗條件。將供試品分別采用3株細胞并在同樣代次下重復檢測3次，連續測定3個細胞代次，然后分別計算重復性檢測結果的平均值和變異系數（CV）。具體實驗設計如下：同時復蘇3株細胞，分別傳至第3代，進行批內3次重復性實驗；取上述細胞的其中1支繼續傳代，分別于細胞的第4代和第5代進行批間3次重復性實驗；不同批次的成品和原液分別測定3次；分別計算批內、批間重復性和不同樣品的重復性檢測結果的平均值和CV。

2 結果

2.1 細胞遷移中重要影響因素的篩選結果

2.1.1 細胞密度篩選結果 在細胞遷移試驗中不同細胞密度的試驗結果如圖1所示。細胞密度為0.5×104/孔時，對照組和實驗組的細胞遷移數目差異顯著，而細胞密度為5×104/孔和1×104/孔時對照組和實驗組差異不顯著。

2.1.2 Vn濃度篩選結果 在細胞遷移試驗中不同Vn密度的試驗結果如圖2所示。Vn濃度為25 μg/mL時，對照組和實驗組的細胞遷移數目差異顯著，而Vn濃度為100和50 μg/mL時對照組和實驗組差異不顯著。

2.1.3 rhTβ4濃度篩選結果 在細胞遷移試驗中不同rhTβ4濃度的試驗結果如圖3所示。細胞遷移指數隨rhTβ4濃度升高而增大，rhTβ4濃度為160 nmol/L時細胞遷移指數最大。

圖1 不同細胞密度對細胞遷移數的影響

圖2 不同Vn濃度對細胞遷移數的影響

圖3 不同rhTβ4濃度對細胞遷移數的影響

2.2 細胞遷移試驗條件優化結果

L9（33）正交試驗設計優化了細胞密度、Tβ4濃度、Vn濃度等3個因素。細胞遷移指數試驗結果見表2，在細胞密度為0.5×104/孔、rhTβ4濃度為200 nmol/L、Vn濃度為12.5 μg/mL時細胞遷移指數最高，達1.96±0.39。對3種影響因素的方差分析結果見表3，本試驗的影響因素主次為rhTβ4濃度＞Vn濃度＞細胞密度。

2.3 專屬性測定結果

結果顯示，供試品組細胞遷移量為359±16，成品輔料組為148±10，對照組為152±19。成品輔料組和對照組的細胞遷移量差異不大，證明成品輔料對本試驗無干擾，該方法專屬性良好。

2.4 重復性測定結果

本試驗批內、批間、原液和成品重復性測定結果見表4。不同批內、批間、原液和成品的細胞遷移指數均為1.61～1.72，細胞遷移指數的變異系數為3.63%～10.91%，均小于15%，提示本試驗重復性較好。

表2 L9（33）正交試驗結果

表3 方差分析表

表4 批內、批間、原液和成品檢測重復性試驗結果

3 討論

我們建立了rhTβ4生物活性測定方法。研究結果表明，rhTβ4能夠促進臍靜脈內皮細胞的遷移，且在實驗條件為細胞密度0.5×104/孔、Tβ4濃度 200 nmol/L、Vn濃度 12.5 μg/mL時，細胞遷移指數最高。與Kozaczuk等[6]的研究結果比較，rhTβ4使用濃度基本一致，但本試驗降低了Vn濃度和細胞密度，而且采用肉眼觀察的方法判定細胞遷移效果，采用計數法統計細胞遷移數量，計算細胞遷移指數，提高了結果判定的準確性。

本試驗首先對細胞遷移試驗中單個影響因素分別進行了篩選，并采用正交試驗設計優化試驗條件，初步建立了檢測方法，在此基礎上進一步進行了方法學驗證。根據方法學試驗結果可知，ECV304細胞遷移法檢測rhTβ4生物學活性，操作簡便，且專屬性強、重復性好、準確性高。本試驗結果為建立rhTβ4生物學活性測定的標準方法奠定了堅實的基礎。

[1]張珍,游顏杰,李維娜,等.重組人胸腺素基因的克隆、表達、純化、鑒定及活性檢測[J].第四軍醫大學學報,2008,29(16):1451-1454.

[2]徐天嬌,張昭,舒震,等.重組人胸腺素β4二串體蛋白的原核表達、純化及生物活性[J].生物技術通訊,2012,23(3):329-332.

[3]李憲奎.人胸腺素β4在大腸桿菌中的克隆、表達、純化及生物學活性鑒定[D].北京:中國協和醫科大學,2008.

[4]丁大有,馬素永,許松山,等.胸腺素β4與藥物開發[J].生命的化學,2012,32(1):67-70.

[5]劉羽佳,李集臨.胸腺素β4研究進展[J].安徽農學通報,2010,16(4):38-44.

[6]Kozaczuk A,Selmi A,Bednarek R.Bacterial expres?sion,purification and angiogenesis-promoting activity of human thymosin β4[J].Protein Expr Purif,2013,90(2):142-152.

[7]Selmi A,Malinowski M,Brutkowski W,et al.Thymo?sin β4 promotes the migration of endothelial cells without intracellular Ca2+elevation[J].Exp Cell Res,2012,318(14):1659-1666.

[8]Freeman K W,Bowman B R,Zetter B R.Regenera?tive protein thymosin-4 is a novel regulator of puriner?gic signaling[J].FASEB J,2011,25(3):907-915.

Development of a Biological Activity Detection Method for Recombinant Human Thymosin β4

XU Hong-Wei1,ZHANG Jun-Ying1,MA Shan-Shan1,TANG Xiao-Chuang1,MA Su-Yong1,2,NIE Li-Ya1,2,XU Song-Shan1,2*
1.Beijing Northland Biotech.Co.,Ltd.,Beijing 100085;2.Beijing Naked Plasmid Gene Therapy Drug Engineering Technology Research Center,Beijing 100085;China

Objective:To control the quality of recombinant human thymosin beta 4（rhTβ4）in vitro,the biologi?cal activity detection method was developed and evaluated.Methods:The ECV304 cell migration method was used to detect the biological activity of rhTβ4.The key factors including cell density,vitronectin（Vn） concentra?tion,rhTβ4 concentration were screened to establish the optimal migration conditions.Results:The highest cell mi?gration rate was observed under the conditions of the cell density 0.5×104/well,Vn concentration 12.5 μg/mL,rhTβ 4 concentration 200 nmol/L,incubation time 24 h and cell migration time 4 h.Conclusion:The developed biologi?cal activity detection method of rhTβ4 has high specificity,accuracy and repeatability,and it can be used for the quality control of rhTβ4.

recombinant human thymosin β4;biological activity detection;cell migration

Q502;Q24

A

1009-0002（2017）05-0661-04

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:xusongshan@northland-bio.com

2017-02-23

徐宏偉（1979- ），女，本科學歷，（E-mail）xuhw0711@163.com

許松山，（E-mail）xusongshan@northland-bio.com