人G3BP1真核表達載體的構建及其在食管癌細胞中的定位分析

張麗娜，黃映輝

北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124

人G3BP1真核表達載體的構建及其在食管癌細胞中的定位分析

張麗娜，黃映輝

北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124

目的：構建GTP酶激活蛋白SH3功能區結合蛋白1（G3BP1）的真核表達載體pEGFP-C3-G3BP1，并觀察其在人食管癌EC109細胞中的表達及定位。方法：采用RT-PCR法從EC109細胞中擴增G3BP1 cDNA全長序列，用限制性內切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切PCR產物后克隆至pEGFP-C3載體，轉化大腸桿菌DH5α后，挑取陽性克隆提取質粒，經雙酶切及測序鑒定；將重組質粒用脂質體法轉染EC109細胞，熒光定量RT-PCR和Western印跡檢測G3BP1的表達，熒光顯微鏡觀察G3BP1的定位。結果：目的基因G3BP1的序列完全正確，并在EC109細胞中獲得表達，熒光顯微鏡觀察顯示G3BP1定位于細胞質。結論：構建了pEGFP-C3-G3BP1真核表達載體，并在EC109細胞中過表達，G3BP1蛋白定位于細胞質，形成應激顆粒（stress granules，SGs）。為進一步探討G3BP1在食管癌細胞中的功能及其與SGs的相關性奠定了基礎。

GTP酶激活蛋白SH3功能區結合蛋白1（G3BP1）；EC109細胞；細胞定位；應激顆粒（SGs）

GTP酶激活蛋白SH3功能區結合蛋白1（Ras-GTase-activating protein SH3 domain binding pro?tein 1，G3BP1）是由Parker等通過免疫共沉淀分離到的第一個RasGAP SH3結構域結合蛋白[1]。G3BP1的相對分子質量為68 000，在進化過程中高度保守，屬于RNA結合蛋白家族，在調控Ras信號轉導過程中起重要作用[2]。哺乳動物細胞中至少存在2種形式的G3BP，即G3BP1和G3BP2。許多證據表明G3BP1具有多種生物學功能，參與細胞生長、轉移、分化、凋亡和RNA代謝等過程。

研究表明G3BP1在多種腫瘤組織和細胞中高表達，包括頭頸部癌、肺癌、結腸癌、肝癌、胃癌和乳腺癌等，而且與腫瘤的侵襲轉移相關[3-6]，這暗示G3BP1可能是一種腫瘤標志物。食管癌是消化系統中一種常見的腫瘤，嚴重危害人類的身體健康。尋找其有效的基因靶點抑制食管癌細胞的生長轉移并進行深入的功能研究，對于提高食管癌患者的生存率和改善食管癌治療具有重要意義。但目前關于G3BP1與食管癌發生發展之間的關系尚不清楚，相關研究報道很少。此外，研究證實在細胞中過表達G3BP1可誘導胞質中形成應激顆粒（stress granules，SGs）[7]。SGs是細胞應對各種毒性刺激反應時在胞質內形成的一種比較大的顆粒，在應激反應時對mRNA代謝起關鍵調控作用，但細胞中過表達G3BP1形成SGs的具體機制也不是很清楚。

蛋白的亞細胞定位情況往往與其功能密切相關，因此，我們通過分子生物學手段構建了帶有綠色熒光蛋白（GFP）標簽的pEGFP-C3-G3BP1真核表達載體，然后轉染食管癌EC109細胞，檢測其在EC109細胞中的表達，并觀察其在EC109細胞中的定位，闡明G3BP1的亞細胞定位特點，為后續的功能及作用機制研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

EC109細胞來源于美國ATCC細胞庫，由本實驗室傳代培養；pEGFP-C3真核表達載體為本實驗室保存；DMEM培養基、胎牛血清（FBS）、0.25% Trypsin-EDTA 和 100×Penicillin-Streptomy?cin Solution雙抗購自Hyclone公司；轉染試劑Li?pofectAMINE 2000購自Invitrogen公司；限制性內切酶HindⅢ、BamHⅠ及T4DNA連接酶購自NEB公司；DNA marker（DL2000和 DL15000）、質粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠電泳膠回收及純化試劑盒和大腸桿菌感受態細胞DH5α均購自天根生化科技（北京）有限公司；BCA蛋白定量試劑盒和RIPA裂解液購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；G3BP1抗體購自GeneTex公司；β-actin抗體購自Cell Signaling Technology（CST）公司；HRP標記的羊抗兔和羊抗鼠二抗購自ABGENT公司；PCR擴增酶Ex Taq、cDNA逆轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser和熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Di?mer Eraser購自大連寶生物工程有限公司；PVDF膜和ECL化學發光底物購自Millipore公司；PCR擴增引物在上海生物工程公司合成。

1.2 G3BP1基因特異性引物設計

根據NCBI網站的人G3BP1基因堿基序列，用Primer Premier 5軟件設計針對G3BP1 ORF的特異性擴增引物。上游引物為5′-GCCCAAGCTTA TGGTGATGGAGAAGCC-3′（劃線處為HindⅢ酶切位點），下游引物為 5′-ATACGGATCCTCACTGCC GTGGCGCAA-3′（劃線處為BamHⅠ酶切位點）。分別在上、下游引物的5′端加上了HindⅢ和BamHⅠ酶切位點及4個保護堿基，擴增1401 bp的人G3BP1全長cDNA序列。

1.3 RT-PCR擴增G3BP1基因

用RNA提取試劑盒提取人食管癌EC109細胞中的總RNA，取1 μg RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄成cDNA。以此為模板，PCR擴增G3BP1的ORF序列1401 bp。PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環，72℃再延伸10 min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目的片段，按照瓊脂糖凝膠電泳膠回收及純化試劑盒說明書進行純化回收。

1.4 pEGFP-C3-G3BP1重組質粒的構建與鑒定

將pEGFP-C3載體與G3BP1基因PCR回收產物分別用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，37℃酶切4 h；瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收線性載體和目的基因片段；在T4DNA連接酶作用下，將pEGFPC3和G3BP1目的片段于16℃反應2 h，然后將連接產物加入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，冰浴30 min，42℃熱激90 s，立即轉入冰中靜置5 min，加入無抗LB 培養基800 μL，在 37℃搖床上振蕩培養1 h（200 r/min），最后將菌液均勻涂布在含卡那霉素的LB平板培養基上，37℃倒置培養過夜。從轉化平板上隨機挑取單菌落，用G3BP1克隆引物進行菌落PCR擴增目的片段，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，將陽性克隆菌落擴大培養，用質粒小提試劑盒提取重組質粒pEGFP-C3-G3BP1，陽性克隆經雙酶切鑒定后測序，測序正確后進一步擴大培養，大量提取重組質粒DNA。

1.5 EC109細胞培養、轉染及熒光觀察

6孔板的各孔接種2×105EC109細胞，放入5%CO2、37℃培養箱中培養24 h，使細胞達到對數生長期，轉染時細胞密度達70%～80%。將6孔板中含10%胎牛血清的DMEM培養基更換為無血清的DMEM培養基，用脂質體轉染試劑Lipo?fectAMINE 2000將pEGFP-C3-G3BP1重組質粒和pEGFP-C3對照質粒轉染至6孔板的細胞培養基中，繼續培養4～6 h，將細胞培養液換成新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養基，于5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養48 h，倒置熒光顯微鏡觀察GFP在EC109細胞中的分布。

1.6 熒光定量RT-PCR檢測轉染EC109細胞G3BP1 mRNA的表達

用0.25%胰酶消化收集轉染了pEGFP-C3對照質粒和pEGFP-C3-G3BP1重組質粒的EC109細胞，用RNA提取試劑盒提取總RNA，取1 μg RNA逆轉錄成cDNA，用熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Dimer Eraser檢測，反應體系為20 μL（10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ，上、下游引物各 0.8 μL，0.4 μL Rox Reference DyeⅡ，ddH2O 6 μL，2 μL cDNA模板），混勻，放入Strat?agene MX3005P熒光定量PCR儀中進行擴增。擴增條件：95℃熱激活 5 min，95℃ 15 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環。G3BP1上游引物序列為 5′-ATGCAGTCTACGGACAGAAAGA-3′，下游引物序列為 5′-GAGCATCAACATGGCGAATCT-3′；內參GAPDH上游引物序列為5′-CGCTCTCTGCTCC TCCTGTT-3′，下游引物序列為 5′-ATGCAGTCTA CGGACAGAAAGA-3′。 通 過 2-ΔΔCt法 計 算 G3BP1 mRNA在EC109細胞中的相對表達量。

1.7 Western印跡檢測轉染EC109細胞G3BP1蛋白的表達

用0.25%胰酶消化收集轉染了pEGFP-C3對照質粒和pEGFP-C3-G3BP1重組質粒的EC109細胞，加入RIPA全細胞裂解液，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，然后加入4×SDS緩沖液沸水煮10 min使蛋白變性。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣40 μg總蛋白，100 V恒壓電泳2 h，90 V恒壓轉膜1 h，然后用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h，分別加入G3BP1抗體（1∶1000）和 β-actin抗體（1∶5000），4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗（1∶6000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；加入ECL化學發光底物顯色成像。

1.8 統計學分析

實驗數據用GraphPad Prism 5統計學軟件處理，2組間的統計比較采用t檢驗分析，P＜0.05時認為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 獲取G3BP1基因全長序列

以食管癌細胞EC109的cDNA文庫為模板，用G3BP1基因特異引物擴增出目的基因的完整ORF，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的片段約為1400 bp，符合要求（圖1）。

圖1 G3BP1基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析

2.2 雙酶切及測序鑒定

重組質粒pEGFP-C3-G3BP1經HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定可見約5.0 kb的線性載體片段（未酶切的環狀pEGFP-C3空質粒大小為4.7 kb）和1401 bp的目的片段，與PCR結果一致，表明目的片段插入成功（圖2）。對重組質粒pEGFP-C3-G3BP1進行測序鑒定，測序結果比對發現與人G3BP1基因的ORF序列完全相同。

圖2 pEGFP-C3-G3BP1重組質粒的HindⅢ/BamHⅠ雙酶切電泳圖譜

2.3 G3BP1在EC109細胞中的表達

將測序正確的重組質粒pEGFP-C3-G3BP1和對照質粒pEGFP-C3轉染EC109細胞，48 h后消化收集細胞，分別提取總RNA和總蛋白。通過熒光定量RT-PCR檢測G3BP1在EC109細胞中mRNA水平的表達，發現與轉染對照質粒相比，G3BP1的表達水平顯著升高，表達量升高大于100倍（圖3A）。通過Western印跡檢測G3BP1在EC109細胞中蛋白水平的表達，發現G3BP1的表達水平也明顯增高（圖3B）。說明pEGFP-C3-G3BP1重組質粒在EC109細胞中獲得表達。

圖3 G3BP1在EC109細胞中的mRNA和蛋白水平表達結果

2.4 G3BP1在EC109細胞中的定位

將測序正確的重組質粒pEGFP-C3-G3BP1和對照質粒pEGFP-C3轉染EC109細胞，48 h后用倒置熒光顯微鏡觀察拍照，綠色熒光代表GFP融合蛋白的亞細胞定位。結果發現在轉染pEGFPC3對照質粒的細胞中，綠色熒光遍布整個細胞，且核質中分布比較均勻（圖4A）；而轉染pEGFPC3-G3BP1重組質粒的EC109細胞中，綠色熒光主要分布在細胞質中，細胞核中沒有看到綠色熒光，即G3BP1與GFP的融合蛋白定位于細胞質。同時，還觀察到30%左右轉染成功的細胞中出現了彌散的綠色熒光顆粒分布，即形成了SGs（圖4C）。上述結果表明在EC109細胞中過表達G3BP1會在細胞質中產生SGs，這與文獻報道的在其他細胞中的研究結果一致，也進一步證明過表達G3BP1是應激顆粒的一個標志物。

圖4 G3BP1在EC109細胞中的亞細胞定位（×200）

3 討論

G3BP1作為第一個RasGAP SH3結構域結合蛋白，在Ras信號轉導過程中起重要調控作用。越來越多的研究表明G3BP1具有多種生物學功能，參與細胞的增殖、轉移、分化、凋亡、RNA代謝和誘導胞質中應激顆粒的形成[8-11]。早期研究表明G3BP1在多種腫瘤組織和細胞中高表達，與腫瘤的侵襲轉移密切相關。Zhang等[12]研究發現，在肺癌細胞H1299中下調G3BP1表達能通過抑制Src/FAK相關的信號通路來抑制肺癌細胞的生長、遷移和侵襲。同樣，在結腸癌細胞HCT116中也發現下調G3BP1的表達抑制結腸癌細胞的生長，并能提高化療藥物的療效[13]。在乳腺癌的研究中發現G3BP1能通過Smad信號通路參與上皮-間質轉化（EMT）誘導的轉移[14]。Dou等[15]在肝癌中的研究表明G3BP1通過上調Slug表達而促進肝癌轉移。以上結果提示G3BP1與腫瘤的發生發展有關，可能是一個潛在的腫瘤治療靶點。

蛋白的表達具有時間和空間特異性，大量研究顯示蛋白質的功能與其亞細胞定位密切相關，因而闡明蛋白質在不同細胞或不同生理、病理狀態下的定位情況，將為其功能研究提供重要線索和理論依據。G3BP1是一種胞質蛋白，主要定位于細胞質，Tourriere等[7]報道G3BP1蛋白在Cos和CCL39細胞內主要分布在細胞質中，核內未見明顯表達，而且在胞質中形成應激顆粒。但G3BP1在腫瘤細胞中的定位與正常細胞中是否有差異，是否也會誘導腫瘤細胞胞質中形成SGs，這些問題有待深入研究。

我們構建了帶有GFP標簽的pEGFP-C3-G3BP1重組真核表達載體，分析G3BP1在食管癌EC109細胞中的表達和定位情況。熒光定量RTPCR和Western印跡結果表明G3BP1在EC109細胞中過表達，熒光顯微鏡觀察顯示轉染pEGFPC3-G3BP1重組質粒的細胞內，綠色熒光主要分布在細胞質中，核內未見明顯表達，而且有一部分細胞的胞質中綠色熒光呈斑點狀分布，即形成了SGs。綜上，我們構建了pEGFP-C3-G3BP1真核表達載體，證實G3BP1是胞質蛋白，能夠誘導腫瘤細胞SGs的形成，但并不是所有成功轉染的細胞中都形成SGs，可能是因為重組質粒的轉染以及細胞處于不同發育周期而造成的差異。本研究為進一步探討G3BP1在食管癌中的功能及其與SGs的相關性提供了途徑和線索。

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Construction of the Eukaryotic Expression Vector for Hu?man G3BP1 Gene and Analysis of its Cellular Localization in Esophageal Cancer Cells

ZHANG Li-Na,HUANG Ying-Hui*
College of Life Science and Bioengineering,Beijing University of Technology,Beijing 100124,China

Objective:To construct the recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-C3-G3BP1 and to inves?tigate the expression and cellular localization of Ras-GTase-activating protein SH3 domain binding protein 1（G3BP1） in human esophageal cancer cell line EC109.Methods:The cDNA of G3BP1 was amplified from EC109 cells by RT-PCR method.The PCR products were digested with restriction endonucleasesHindⅢandBamHⅠ and subcloned into pEGFP-C3 vector.After transformation intoE.coliDH5α,the postive clones were picked for plasmid extraction and identified by double digestion and sequencing analysis.The recombinant plasmid was transfected into EC109 cells by liposome transfection method,and then the expression of G3BP1 was detected by fluorescence quantitative RT-PCR and Western blot analysis.The cellular localization of G3BP1 was observed by fluorescence microscopy.Results:The sequence of G3BP1 gene was correct and expressed in EC109 cells.G3BP1 was localized in the cytoplasm of EC109 cells.Conclusion:Eukaryotic expression vector pEGFP-C3-G3BP1 was constructed and expressed in EC109 cells.G3BP1 protein was mainly localized in the cytoplasm of EC109 cells and induced the formation of stress granules（SGs）.These findings can help to further study on the functions of G3BP1 in esophageal cancer cells and its correlation with SGs.

Ras-GTase-activating protein SH3 domain binding protein 1（G3BP1）;EC109 cells;cellular local?ization;stress granules（SGs）

Q78;Q24

A

1009-0002（2017）05-0623-06

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:yhuang@bjut.edu.cn

2017-02-20

北京市科委重點項目（Z151100003915073）；北京市博士后工作經費資助項目（2016ZZ-33）

張麗娜（1986- ），女，博士，講師，（E-mail）lnzhang@bjut.edu.cn

黃映輝，（E-mail）yhuang@bjut.edu.cn