類泛素蛋白FAT10對人腎上皮細胞α-烯醇酶共價修飾的初步研究

陳圳川，冷泠，季守平

軍事醫學科學院 野戰輸血研究所組織工程研究室，北京 100850

類泛素蛋白FAT10對人腎上皮細胞α-烯醇酶共價修飾的初步研究

陳圳川，冷泠，季守平

軍事醫學科學院 野戰輸血研究所組織工程研究室，北京 100850

目的：構建帶Flag標簽的α-烯醇酶（ENO1）基因以及帶Myc標簽的人白細胞抗原F相關轉錄物10（FAT10）基因的真核表達質粒載體，鑒定ENO1和FAT10在人腎上皮細胞株HEK293中的表達，檢測類泛素蛋白FAT10是否共價修飾ENO1。方法：以人宮頸癌細胞系HeLa的cDNA為模板進行PCR，得到eno1目的片段，與分別經EcoRⅤ和SalⅠ酶切的pFlag-CMV載體連接得到重組質粒pFlag-CMV-eno1并進行鑒定測序；以人腦組織cDNA文庫為模板進行PCR，得到fat10目的片段，與分別經EcoRⅠ和XhoⅠ酶切的pCMV-Myc載體連接得到重組質粒pCMV-Myc-fat10并進行鑒定并測序。將重組質粒用脂質體法轉染HEK293細胞，用Western印跡檢測ENO1和FAT10蛋白的表達。將重組質粒共轉染HEK293細胞，用免疫共沉淀檢測FAT10對ENO1的修飾情況。結果：重組克隆載體內的eno1和fat10序列與GenBank報告的序列完全一致；轉染HEK293細胞后，ENO1和FAT10蛋白過表達；FAT10能夠共價修飾ENO1。結論：類泛素蛋白FAT10共價修飾ENO1，為腫瘤的發生、發展及遷移的研究提供了新的研究思路。

α-烯醇酶（ENO1）；人白細胞抗原F相關轉錄物10（FAT10）；真核表達；共價修飾

α-烯醇酶（α-enolase，ENO1）是由2個含433個氨基酸殘基、相對分子質量約47 000的亞單位構成的二聚體[1]，作為糖酵解酶在細胞質中起催化作用，催化2-磷酸-D-甘油酸在糖酵解途徑中脫水成磷酸烯醇丙酮酸[2]。在細胞膜上，ENO1可作為影響細胞遷移的纖溶酶原受體[3-4]。有文獻報道，α-烯醇酶在癌癥轉移中具有顯著作用[2]，在膜上表達的α-烯醇酶能促進ECM降解和癌細胞的侵襲[3，5]，靶向敲除在膜表達的α-烯醇酶能夠有效抑制腫瘤的轉移[6]。

人白細胞抗原F相關轉錄物10（human leuko?cyte antigen F-associated transcript 10，FAT10），是相對分子質量為18 000的類泛素蛋白，可介導底物被26S蛋白酶體降解[7-8]。多項研究發現FAT10在各種癌癥如胃腸癌、肝癌、胰腺導管腺癌和人神經膠質瘤中高表達[9]，FAT10表達的變化可誘導與腫瘤形成相關的異常細胞生長[9-10]。這些都表明FAT10可能在癌癥的發生發展中發揮重要作用[7,11-12]。最近的研究表明，FAT10基因敲除后的小鼠表現出壽命延長以及患肥胖病幾率減少等現象，提示FAT10在影響衰老和慢性疾病的免疫代謝調節中發揮作用[13-14]，但具體機制不甚清楚。本研究旨在探討FAT10是否能夠共價修飾ENO1，從而參與腫瘤的發生發展過程。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α感受態菌株購于天根生物技術公司；限制性內切酶EcoRⅤ和SalⅠ、T4DNA連接酶購于NEB公司；ExTaq酶購于TaKaRa公司；PCR產物回收試劑盒購于威格拉斯公司；質粒提取試劑盒購于OmegaBiotek公司；Myc標簽抗體和Flag標簽抗體購于CST公司。

1.2 pFlag-CMV-eno1標簽載體的構建

根據GenBank數據庫提供的ENO1氨基酸序列，分別在上、下游引物中引入EcoRⅤ和SalⅠ酶切位點。上游引物為5'-CGGATATCTTCTTCAGG TCTGGGAAGTATG-3'，下游引物為5'-CCGGTCG ACGGTTGCAGGACTTCTCGTTC-3'。以人宮頸癌細胞系HeLa的cDNA為模板進行PCR（94℃預變性3 min；94℃ 30 s，65℃ 45 s，72℃ 1.5 min，30個循環；72℃延伸10 min）。PCR擴增產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果并拍照。用試劑盒回收擴增的目的片段，并與經EcoRⅤ和SalⅠ雙酶切的pFlag-CMV載體連接，轉化大腸桿菌DH5α菌株，陽性克隆經測序正確后提取質粒。

1.3 pCMV-Myc-fat10標簽載體的構建

根據人類蛋白質參考數據庫（human protein reference database，HPRD）提供的FAT10氨基酸序列，分別在上、下游引物中引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點。上游引物為5'-CTCTCGAGTCAATGGCT CCCAATGCTTCC-3'，下游引物為5'-GGCGAATT CTCTCACCCTCCAATACAATAA-3'。以人腦組織cDNA文庫為模板進行PCR（94℃預變性3 min；94℃ 30 s，65℃ 45 s，72℃ 1.5 min，35 個循環；72℃延伸10 min）。PCR 擴增產物行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果并拍照。用試劑盒回收擴增的目的片段，并與經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切的pCMV-Myc載體連接，轉化大腸桿菌DH5α菌株，陽性克隆經測序正確后提取質粒。

1.4 細胞培養及質粒轉染

將培養的HEK293細胞接種到細胞培養皿中，加入含10%胎牛血清和雙抗的新鮮DMEM培養基培養24 h，細胞融合度為70%時更換新鮮無血清無雙抗培養基，將質粒與脂質體按體積比1∶3混合，每個培養皿中轉入質粒3 μg，6 h后換上新鮮的含10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養基，48 h后加入細胞裂解液，收集細胞，提取蛋白，SDS-PAGE分離，隨后進行免疫印跡分析。

1.5 免疫共沉淀

重組載體共轉染48 h后，將HEK293細胞用PBS洗滌3次，加入細胞裂解液裂解細胞，裂解產物在4℃下與目的抗體孵育4 h后離心（4℃，2500 r/min，5 min）；將蛋白A/G瓊脂糖加入裂解產物，于4℃進一步孵育4 h；收集和洗滌結合的蛋白質，將樣品煮沸10 min，SDS-PAGE分離，隨后進行免疫印跡分析。

2 結果

2.1 pFlag-CMV-eno1質粒的構建及序列檢測

以人宮頸癌細胞系HeLa的cDNA為模板進行PCR，擴增產物的1%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1，擴增片段約為1305 bp，與GenBank所示的分子質量完全吻合。用試劑盒回收擴增的目的片段，并與經EcoRⅤ和SalⅠ雙酶切的pFlag-CMV載體連接。對重組質粒pFlag-CMV-eno1進行序列檢測，其部分測序結果見圖2。

圖1 eno1片段PCR產物瓊脂糖電泳圖

圖2 重組質粒pFlag-CMV-eno1部分測序圖

2.2 pCMV-Myc-fat10質粒的構建及序列檢測

以人腦組織cDNA庫為模板進行PCR，擴增產物的1%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖3，擴增片段約為971 bp，與GenBank所示分子質量完全吻合。用試劑盒回收擴增的目的片段，并與經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切的pFlag-CMV載體連接。對重組質粒pCMV-Myc-fat10進行序列檢測，其部分測序結果見圖4。

圖3 fat10片段PCR產物瓊脂糖電泳圖

圖4 重組質粒pCMV-Myc-fat10部分測序圖

2.3 目的蛋白在293細胞中的表達

將構建的質粒pFlag-CMV-eno1和pCMVMyc-fat10用脂質體法分別轉入HEK293細胞，48 h后加入細胞裂解液，收集細胞，提取蛋白。Western印跡結果顯示，質粒組pFlag-CMV-eno1在相對分子質量約47 000處有單一條帶（圖5），pCMV-Myc-fat10在相對分子質量約17 000處有單一條帶（圖6）。

圖5 Western印跡檢測重組質粒pFlag-CMV-eno1在293細胞中的表達

圖6 Western印跡檢測重組質粒pCMV-Myc-fat10在293細胞中的表達

2.4 FAT10能夠共價修飾ENO1

將構建的質粒pFlag-CMV-eno1和pCMVMyc-fat10用脂質體法共轉入HEK293細胞，48 h后加入細胞裂解液，裂解產物在4℃與Flag抗體孵育4 h后2500 r/min離心5 min，將蛋白A/G瓊脂糖加入裂解產物，4℃進一步孵育4 h，收集和洗滌結合的蛋白質，將樣品煮沸10 min，行SDSPAGE分離，隨后進行免疫印跡分析。結果見圖7，在相對分子質量約65 000處有一條帶，而ENO1-FAT10共軛體大小也為65 000。提示FAT10能夠共價修飾ENO1。

圖7 免疫共沉淀檢測蛋白FAT10共價修飾ENO1

3 討論

ENO1在癌癥轉移中有顯著作用。ENO1從細胞質轉移到細胞表面結合纖溶酶原（PLG）以增強細胞周質纖維蛋白溶酶的產生和細胞運動性。在肺癌、結腸癌和急性髓細胞樣白血病中，ENO1表達上調。FAT10能介導靶蛋白的降解及細胞凋亡，其表達能夠被p53負調控，多項研究表明FAT10在各種癌癥中高表達,并可能在癌癥中發揮重要作用。我們構建了pFlag-CMV-eno1和pCMV-Myc-fat10表達質粒,并將這2種質粒共轉入HEK293細胞，通過免疫沉淀發現在細胞中FAT10能夠共價修飾ENO1。這提示我們FAT10可能通過共價修飾ENO1影響和調控腫瘤的發生和轉移。目前，尚有許多問題待闡明，比如，類泛素蛋白FAT10共價修飾ENO1如何調控腫瘤的遷徙能力，其中是否依賴蛋白酶體水解系統；FAT10和ENO1共同參與的信號通路有哪些等等。以上具體的作用機制還不清楚，值得進行深入探究，為癌癥的發生與發展提供新的研究方向。

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A Preliminary Study on the Covalent Modification of α-Enolase in Human Renal Epithelial Cells by Ubiquitin-Like Protein FAT10

CHEN Zhen-Chuan,LENG Ling，JI Shou-Ping*
Tissue Engineering Lab,Beijing Institute of Transfusion Medicine,Beijing 100850,China

Objective:Through co-express two eukaryotic plasmids carrying Flag-tagged α-enolase（ENO1） gene and Myc-tagged F-related transporter 10（FAT10） gene to detect modification of ENO1 by FAT10 in HEK293 cell lines.Methods:Theeno1target fragment was obtained by PCR from the cDNA of HeLa cells and inserted into pFlag-CMV vector,and the constructed plasmid pFlag-CMV-eno1 was identified by sequencing.Thefat10frag?ment was obtained by PCR from human brain tissue cDNA library as template,and cloned into pCMV-Myc vec?tor,and the constucted plasmid pCMV-Myc-fat10 was identified by sequencing.The two recombinant plasmids were co-transfected into HEK293 cell lines by liposome method,and Western blotting was used to detect the ex?pression of ENO1 and FAT10 protein,and the co-immunoprecipitation method was used to detect whether ENO1 and FAT10 proteins could interact in cells.Results:Theeno1sequence andfat10sequence in the recombinant cloning vector were identical with those reported data by GenBank.ENO1 and FAT10 proteins significantly ex?pressed in HEK293 cell lines,and ENO1 was covalently modified by Ubiquitin protein FAT10.Conclusion:ENO1 is covalently modified by Ubiquitin protein FAT10 in HEK293 cell lines,which is a clue to study the de?velopment and immigration of tumor cells.

α-enolase（ENO1）;human leukocyte antigen F-associated transcript 10（FAT10）;eukaryotic expres?sion;covalent modification

Q78

A

1009-0002（2017）05-0614-04

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:jishouping@yahoo.com

2017-03-02

陳圳川（1992- ），男，碩士研究生，（E-mail）14789866055@163.com

季守平，（E-mail）jishouping@yahoo.com