人ERK2基因?qū)θ艘暰W(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

韓笑，劉瑩，梁迎春，閆志風(fēng)，徐小潔，梁九思，洪甜，尤文葉，陳思禹，黃俊，葉棋濃，劉丹

1.錦州醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；2.解放軍總醫(yī)院，北京 100853；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

人ERK2基因?qū)θ艘暰W(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

韓笑1,3，劉瑩1，2，梁迎春3，閆志風(fēng)2，徐小潔3，梁九思1，洪甜3，尤文葉2，陳思禹2，黃俊3，葉棋濃3，劉丹1

1.錦州醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；2.解放軍總醫(yī)院，北京 100853；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850

目的：構(gòu)建攜帶Myc標(biāo)簽的人細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2（ERK2）的真核表達(dá)載體，表達(dá)Myc-ERK2融合蛋白，檢測(cè)其對(duì)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。方法：采用PCR技術(shù)從乳腺文庫(kù)中擴(kuò)增人ERK2基因序列，將其插入pXJ-40載體；將重組質(zhì)粒與空載體轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1細(xì)胞系后，Western印跡檢測(cè)表達(dá)情況，并進(jìn)行生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：雙酶切和測(cè)序鑒定表明Myc-ERK2真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功；轉(zhuǎn)染W(wǎng)ERI-Rb-1細(xì)胞后融合蛋白獲得表達(dá)，生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ERK2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。結(jié)論：攜帶Myc標(biāo)簽的人ERK2基因的真核表達(dá)載體能在人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb-1細(xì)胞中表達(dá)，且能促進(jìn)該細(xì)胞的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究ERK2在腫瘤尤其是眼惡性腫瘤中的功能奠定了基礎(chǔ)。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2（ERK2）；真核表達(dá)；人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）成員之一[1-2]，其N端與C端相互卷曲形成一種典型的雙葉結(jié)構(gòu)的多肽鏈[3]。ERK家族有5個(gè)亞族，即ERK1、ERK2、ERK3、ERK4和 ERK5。對(duì) ERK1和ERK2調(diào)節(jié)不同細(xì)胞內(nèi)的減數(shù)分裂和有絲分裂等一系列生理活動(dòng)的研究比較明確[4]。研究表明，血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth fac?tor，PDGF）能通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路影響視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的增殖和遷移[5]。ERK2還參與信號(hào)通路的激活和腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可通過(guò)磷酸化底物蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能，調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、轉(zhuǎn)錄、分化、凋亡、遷移和黏附等功能，在惡性腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)等方面起重要作用[4,6]。因此，我們擬構(gòu)建ERK2的真核表達(dá)載體，以便進(jìn)一步研究ERK2與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的調(diào)控。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、人乳腺文庫(kù)、真核表達(dá)載體pXJ-40為本實(shí)驗(yàn)室保存；VigoFect轉(zhuǎn)染試劑、Western印跡發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Vigorous公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、PCR相關(guān)試劑購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司；新生牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；DMEM購(gòu)自Gibco公司；胰酶購(gòu)自Amersco公司；引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成；測(cè)序由北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 ERK2基因的擴(kuò)增

以人乳腺文庫(kù)為模板，根據(jù)NCBI中的ERK2序列合成上游引物（5'-CCCAAGCTTATGGCGGC GGCGGCGGCGGC-3'）和下游引物（5'-CCGCTCG AGTTAAGATCTGTATCCTGGCTGGAATC-3'），PCR擴(kuò)增ERK2序列（擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃ 5 min；變性95℃ 30 s，退火 60℃ 30 s，延伸72℃ 50 s，30個(gè)循環(huán)；再延伸72℃ 7 min）。使用高保真PfuDNA聚合酶，擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存，用膠回收試劑盒回收。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切pXJ-40載體，37℃，4 h，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切，暴露出酶切位點(diǎn)的粘性末端，用T4DNA連接酶連接入pXJ-40載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，振蕩培養(yǎng)并提質(zhì)粒，用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的克隆送北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Western印跡檢測(cè)

按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法轉(zhuǎn)染。用含雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將HEK293T細(xì)胞接種于6 cm皿中，接種量以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度達(dá)80%為宜，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1 h換液。將4 μL VigoFeet與 200 μL NaCl混合，室溫靜置 5 min，再將總量為10 μg的重組質(zhì)粒Myc-ERK2與200 μL NaCl混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中，并以同樣方法轉(zhuǎn)染空載體作為對(duì)照，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4～6 h更換為正常DMEM培養(yǎng)液，24 h后收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液冰浴30 min，加入等量的2×SDS緩沖液，煮沸15 min，12 000 r/min離心2 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜，隨后用5%脫脂奶粉以1∶1000稀釋HRP標(biāo)記的抗Myc標(biāo)簽鼠單克隆抗體進(jìn)行孵育，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.5 生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)

將Myc-ERK2和空載體轉(zhuǎn)染W(wǎng)ERI-Rb-1細(xì)胞，48 h后取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，計(jì)數(shù)后稀釋至2×104/L，分別接種于5個(gè)96孔板，各設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)。每日取一塊96孔板，在接種孔內(nèi)用排槍加入10 μL CCK-8溶液，37℃放置1～4 h，在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定樣品D值。

2 結(jié)果

2.1 人ERK2基因的克隆

以人乳腺文庫(kù)為模板擴(kuò)增ERK2基因，獲得約1080 bp的PCR產(chǎn)物，與預(yù)期一致（圖1）。

圖1 ERK2基因的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 Myc-ERK2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將PCR產(chǎn)物雙酶切后與pXJ-40載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，凝膠電泳可見(jiàn)約1080 bp的條帶（圖2），表明ERK2序列已成功插入Myc標(biāo)簽中。測(cè)序結(jié)果顯示與已知序列完全一致，從而證明重組質(zhì)粒Myc-ERK2構(gòu)建成功。

圖2 Myc-ERK2重組質(zhì)粒酶切瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 Western印跡檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒Myc-ERK2和空載分別轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，4～6 h后更換為DMEM完全培養(yǎng)液，24 h后提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE，

圖3 Western印跡檢測(cè)融合蛋白Myc-ERK2的表達(dá)

2.4 生長(zhǎng)曲線檢測(cè)ERK2表達(dá)對(duì)WERI-Rb-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

圖4 ERK2能促進(jìn)WERI-Rb-1細(xì)胞的生長(zhǎng)

為了探討WERI-Rb-1細(xì)胞中ERK2活性對(duì)其增殖是正調(diào)控還是負(fù)調(diào)控，用CCK8試劑盒檢測(cè)ERK2對(duì)WERI-Rb-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果證明ERK2能促進(jìn)WERI-Rb-1細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖4）。Western印跡檢測(cè)Myc-ERK2蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Myc-ERK2后，在相對(duì)分子質(zhì)量約43 000處可見(jiàn)明顯的特異性條帶，而轉(zhuǎn)染空載體后則無(wú)條帶，表明重組蛋白Myc-ERK2能在HEK293T細(xì)胞中正確表達(dá)（圖3）。

3 討論

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（retinoblastoma，RB）是一種起源于視網(wǎng)膜胚胎性的眼內(nèi)惡性腫瘤，多發(fā)于嬰幼兒，發(fā)病率為1∶15 000，近年來(lái)仍有逐漸上升趨勢(shì)。血-視網(wǎng)膜屏障（blood-retina barrier，BRB）由內(nèi)層BRB（inner BRB，IBRB）及外層BRB（outer BRB，OBRB）組成，在維持視網(wǎng)膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起非常重要的作用[7-9]。ERK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶[10]，ERK通路在MAPK通路中起重要作用。MAPK通路由Ras/Raf/MEK/ERK通路組成，其信號(hào)的傳導(dǎo)遵循MAKP的三級(jí)聯(lián)體系，即MAPK、MAPK激酶（MAPK kinase，MAPKK）、MAPKK激酶（MAPKK kinase，MAPKKK），激活順序依次為：MAPKKK激活MAPKK，MAPKK激活MAPK，活化后的MAPK進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄的激活[11-12]。研究表明，阻斷小鼠體內(nèi)ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，可以減少缺氧條件下OBRB的被破壞[13]。視網(wǎng)膜缺血和再灌注廣泛參與眼部疾病，引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell，RGC）死亡，導(dǎo)致視覺(jué)障礙和失明[14]。Gao等研究發(fā)現(xiàn)，p-ERK蛋白抑制ERK活性上調(diào)對(duì)缺血性腦損傷和損傷RGC有明顯的保護(hù)作用[15]。同時(shí)，ERK通路的異常與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)。研究表明ERK2的活化可改變細(xì)胞病理性增殖，雌激素可通過(guò)對(duì)ERK2通路的影響來(lái)抑制動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖[16]。在腎臟中，ERK2通路參與急性腎衰竭的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡增加和炎性標(biāo)記物增加[17]。在乳腺癌中，ERK2的過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡[18]。在肝癌中，ERK2的活化和過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移能力[19]。因此，研究ERK2有助于明確腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡機(jī)制及對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響，進(jìn)而指導(dǎo)腫瘤的治療和新藥的研制。

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Effect of HumanERK2Gene on Growth of Human Retino?blastoma WERI-Rb-1 Cells

HAN Xiao1,3,LIU Ying1,2,LIANG Ying-Chun3,YAN Zhi-Feng2,XU Xiao-Jie3,LIANG Jiu-Si1,HONG Tian3,YOU Wen-Ye2,CHEN Si-Yu2,HUANG Jun3,YE Qi-Nong2*,LIU Dan1*
1.The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000;2.Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853;3.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;China

Objective:To construct the eukaryotic expression vector of human extracellular signal regulated ki?nase 2（ERK2） labeled with Myc and detect its expression and activity in human retinoblastoma cells.Methods:Human ERK2 coding region was amplified from human mammary cDNA library by PCR and cloned into pXJ-40 vector.The recombinant plasmid Myc-ERK2 was transfected into human WERI-Rb-1 cells and the expression was detected by Western blot.The proliferation of WERI-Rb-1 cells was examined by growth curve experiment.Results:Myc-ERK2 eukaryotic expression vector was constructed and verified by double enzyme digestion and nu?cleic acid sequencing.Human ERK2 protein was expressed in human WERI-Rb-1 cells as was shown by West?ern blot results and ERK2 protein promoted the proliferation of WERI-Rb-1 cells.Conclusion:The Myc-ERK2 was identified to promote WERI-Rb-1 cell proliferation,which is a fundamental study for ERK2's role in retinob?laastoma.

human extracellular signal regulated kinase 2（ERK2）;eukaryotic expression;human retinoblastoma cells

Q78

A

1009-0002（2017）05-0610-04

10.3969/j.issn.1009-

*Co-corresponding authors,LIU Dan,E-mail:docliu61@163.com;YE Qi-Nong,E-mail:yeqn66@yahoo.com

2017-04-27

國(guó)家自然科學(xué)基金（81672602，81472589，81502264）；北京市科技新星計(jì)劃（Z141102001814055）；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院創(chuàng)新基金轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)項(xiàng)目（ZHYX003）

韓笑（1989- ），女，碩士研究生，（E-mail）hanxiao9910@sina.com；劉瑩（1981- ），女，博士研究生，（E-mail）liuying5322@163.com；梁迎春（1979- ），女，博士研究生，（E-mail）lyc.513@163.com；三者為共同第一作者

劉丹，（E-mail）docliu61@163.com；葉棋濃，（E-mail）yeqn66@yahoo.com