腫瘤壞死因子α對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞生物學特性的影響

杜春彥，張歡，楊靜，王曉晨，馮澤國，郭全義

1.清華大學附屬北京清華長庚醫(yī)院 麻醉科，北京 102218；2.解放軍總醫(yī)院 麻醉手術中心，北京 100853；3.骨科再生醫(yī)學北京市重點實驗室，全軍骨科戰(zhàn)創(chuàng)傷重點實驗室，北京 100853

腫瘤壞死因子α對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞生物學特性的影響

杜春彥1，張歡1，楊靜2，王曉晨2，馮澤國2，郭全義3

1.清華大學附屬北京清華長庚醫(yī)院 麻醉科，北京 102218；2.解放軍總醫(yī)院 麻醉手術中心，北京 100853；3.骨科再生醫(yī)學北京市重點實驗室，全軍骨科戰(zhàn)創(chuàng)傷重點實驗室，北京 100853

目的:探討不同濃度腫瘤壞死因子α（TNF-α）對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）生物學特性的影響。方法:采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化，流式細胞儀檢測BMSCs表面標記物；分別以10、100、1000 ng/mL的TNF-α完全培養(yǎng)液預處理P3代BMSCs，并設置僅含培養(yǎng)基的空白對照組，24 h后采用ELISA試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-10的表達水平；胰酶消化細胞，用PrestoBlue法檢測10、100、1000 ng/mL TNF-α完全培養(yǎng)液預處理BMSCs后細胞增殖活性。結果：ELISA檢測結果顯示，與對照組相比，各濃度TNF-α干預組IL-6、IL-10均有不同程度升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且1000 ng/mL TNF-α干預組IL-10表達水平最高，其濃度為170.2±11.9 pg/mL，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；100 ng/mL TNF-α干預組IL-6表達水平最高，其濃度為144.0±18.6 pg/mL，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。PrestoBlue檢測結果顯示，與對照組相比，10、100、1000 ng/mL TNF-α干預組熒光值均增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但組間熒光值比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：10～1000 ng/mL TNF-α可促進BMSCs的增殖，且隨著TNF-α濃度的升高，BMSCs分泌促炎因子IL-6的能力降低,分泌抑炎因子IL-10的能力升高。

骨髓間充質(zhì)干細胞；促炎因子；抑炎因子；腫瘤壞死因子α

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchy?mal stem cells，BMSCs）是具有自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞，因具有低免疫性、易分離擴散、免疫調(diào)節(jié)及抗炎等特性，而成為組織工程和再生醫(yī)學中的理想種子細胞[1-3]。作為細胞和基因治療的載體，BMSCs目前已在多種疾病如帕金森病、中風、腦干損傷、心肌梗死、脊髓損傷、外周神經(jīng)損傷中得到應用[4]，但移植到損傷組織的細胞快速凋亡限制了BMSCs的廣泛應用。近年有研究提出BMSCs所處的微環(huán)境是影響細胞生長和旁分泌功能的基本因素，干細胞移植微環(huán)境中炎性因子水平的高低不僅決定BMSCs的生存活性，還顯著影響B(tài)MSCs功能的發(fā)揮[5]。Mi?ettinen等研究發(fā)現(xiàn)，急性組織損傷時，靶組織中急性升高的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）水平對BMSCs的歸巢定植及旁分泌功能均有促進作用[6]。Covey等研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α是炎性反應過程中最早出現(xiàn)且最具有代表性的多功能炎性因子之一，微環(huán)境中TNF-α水平的高低不僅可促進白細胞介素IL-1β、IL-6等炎性因子的瀑布反應，還促使BMSCs在炎性環(huán)境下發(fā)生表型轉換，影響B(tài)MSCs對疾病的調(diào)控作用[7]。因此，在本研究中，我們擬以大鼠來源的BMSCs為代表，通過添加不同濃度的TNF-α模擬BMSCs所處的炎性環(huán)境，探討TNF-α完全培養(yǎng)液預處理對大鼠BMSCs活性及旁分泌作用的影響，為BMSCs在臨床上的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

健康清潔級雄性 SD 大鼠（60～80 g，4～6周齡）由解放軍總醫(yī)院動物研究中心提供；SD大鼠BMSCs基礎培養(yǎng)基α-MEM、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素雙抗、谷氨酰胺等購自Gibco公司；0.25%胰酶購自康寧公司；CD29抗體、CD90抗體購自BD公司；CD34、CD45購自Abcam公司。

1.2 大鼠原代BMSCs的分離培養(yǎng)

選取4～6周齡SD大鼠6只，戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后處死，切開皮膚，暴露肌肉，取股骨、脛骨，于75%酒精中浸泡15 min后移入超凈臺，充分分離附著肌肉，顯露骨髓腔，用α-MEM反復緩慢沖洗骨髓腔至骨發(fā)白，收集沖洗液移入離心管，1500 r/min離心5 min后棄上清，取α16培養(yǎng)液10 mL重懸，吹打均勻后以2×105/cm2的濃度接種于T25培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用差異貼壁法分離純化細胞，待細胞達到80%融合時傳代培養(yǎng)。

1.3 大鼠BMSCs的流式細胞術鑒定

將融合率達到80%的P3代BMSCs常規(guī)消化成細胞懸液后，離心去上清，加入PBS重懸，細胞計數(shù)；再次離心去上清，PBS清洗2次，調(diào)整流式管中BSMCs密度至1×106/mL，每管依次加入抗大鼠 CD29-AF647（5 μL）、CD34-PECY7（20 μL）、CD45-PE（10 μL）、CD90-PE（10 μL）抗體和同型對照抗體，室溫避光孵育30 min后去除未結合抗體，用300 μL PBS重懸，上機檢測前加入700 μL PBS混勻，利用流式細胞儀對細胞表面分子標記物進行鑒定。

1.4 ELISΑ 法測定BMSCs分泌IL-6、IL-10的水平

取P3代BMSCs，常規(guī)消化細胞，離心計數(shù)，以1×105/孔接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜；次日棄去培養(yǎng)液，分別加入10、100、1000 ng/mL TNF-α完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，設0 ng/mL為空白對照，每組均設3個復孔，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，吸取培養(yǎng)液上清，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清，用ELISA試劑盒于酶標儀上檢測D450nm值，檢測后用胰酶消化細胞，用于后續(xù)試驗。

1.5 PrestoBlue試劑檢測TNF-α預處理后BMSCs的增殖活性

取上述經(jīng) 0、10、100、1000 ng/mL TNF-α 處理過的BMSCs，胰酶消化、計數(shù)，取96孔板，每孔加入 5×104BMSCs（100 μL），于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，將PrestoBlue試劑加入孔板，每孔10 μL，37℃孵育10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀（激發(fā)波長560 nm，發(fā)射波長590 nm）測定每孔熒光值（Fluorescence）。

2 結果

2.1 BMSCs形態(tài)觀察

由骨髓分離的細胞體外培養(yǎng)2 d后，細胞呈懸浮樣生長，細胞形態(tài)以圓形為主，鏡下可見細胞呈梭形或多角形態(tài)，隨著換液和繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶中貼壁細胞數(shù)量逐漸增多，懸浮細胞數(shù)量減少。原代培養(yǎng)的細胞在接種1周后細胞集落達到80%融合（圖1Α）。傳代后的BMSCs分裂、增殖速度明顯變慢，大部分貼壁細胞保持長梭形，培養(yǎng)2～3周后雜質(zhì)細胞明顯減少，細胞呈放射狀排列，融合片狀生長，形成典型漩渦狀形態(tài)，細胞純度較高（圖1B）。

圖1 原代培養(yǎng)BMSCs形態(tài)（×100）

2.2 BMSCs的流式鑒定結果

流式細胞分析技術顯示CD29（99.59%）、CD90（83.95%）呈陽性表達，CD34（0.1%）、CD45（7%）呈陰性表達。表明分離培養(yǎng)的細胞在細胞表面標志物方面符合BMSCs的生物學特性且純度較高，適合實驗需要。

2.3 不同濃度TNF-α預處理后BMSCs分泌IL-6和IL-10的變化

ELISA結果顯示，與對照組（13.469±3.717 pg/mL）相比，各濃度TNF-α干預組IL-6表達水平均有不同程度升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。其中100 ng/mL TNF-α干預組IL-6分泌最多，濃度為 143.980±18.639 pg/mL，與 10、1000 ng/mL TNF-α干預組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組（12.967±2.820 pg/mL）相比，各濃度TNF-α干預組IL-10表達水平均有不同程度升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。1000 ng/mL TNF-α干預組IL-10分泌最多，濃度為170.221±11.864 pg/mL，與10、100 ng/mL TNF-α干預組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）

2.4 Prestoblue試劑檢測TNF-α處理后BMSCs的生長活性變化

不同濃度TNF-α作用24 h后，BMSCs生長活性較對照組增高，其中10 ng/mL TNF-α干預組細胞生長活性最強，其熒光值為890.203±75.559，與空白組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.005）；100、1000 ng/mL TNF-α組與空白組相比，差異有統(tǒng)計學意義，但TNF-α各濃度組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

3 討論

BMSCs常被移植到炎癥環(huán)境中，并通過自分泌、旁分泌功能產(chǎn)生大量炎性因子，調(diào)節(jié)宿主的免疫反應。干細胞因這一特性，已在肺損傷、糖尿病、敗血癥、無菌模型角膜損傷和中風等動物模型中取得良好的治療效果[8-9]。由于移植到損傷組織后的BMSCs仍處于炎性微環(huán)境中，炎性介質(zhì)對BMSCs的生存及疾病調(diào)控作用有重要影響，因此，探索移植后微環(huán)境對BMSCs的生存及功能的影響具有重要意義。TNF-α是組織損傷后最先釋放的細胞因子，被認為是炎癥信號級聯(lián)反應的啟動因子，極低水平的TNF-α即可與BMSCs表面的Toll樣受體（TLR）結合，促進干細胞合成和釋放IL-6和IL-10等炎性因子[10-12]。本實驗選用不同濃度的TNF-α模擬BMSCs在體內(nèi)所處的微環(huán)境，采用PrestoBlue方法觀察細胞活性，ELISA法測定BMSCs分泌炎性因子IL-6、IL-10的水平，探討B(tài)MSCs在不同炎性環(huán)境下生長活性及旁分泌功能的變化，為臨床研究打下了基礎。

圖2 流式細胞儀檢測BMSCs表面分子標記物

圖3 TNF-α刺激下BMSCs分泌IL-6、IL-10含量變化

圖4 TNF-α預處理后BMSCs的熒光值

PrestoBlue檢測結果提示，10～1000 ng/mL的TNF-α促進BMSCs增殖，但隨著TNF-α濃度的增加，BMSCs增殖幅度逐漸降低，提示高濃度的TNF-α可抑制BMSCs的增殖幅度。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，隨著TNF-α刺激濃度的升高，IL-6的增加幅度逐漸降低，BMSCs分泌促炎因子IL-6的能力逐漸下降；IL-10的增加幅度逐漸提高，BMSCs分泌抑炎因子IL-10的能力逐漸升高，提示BMSCs的旁分泌功能受炎性微環(huán)境環(huán)境的影響。LI等研究發(fā)現(xiàn)，在急性炎癥反應期，低水平的促炎因子TNF-α、LPS、GM-CSF可誘導BMSCs向M1方向極化[13]。BMSCs分泌大量促炎因子，主要參與體內(nèi)炎性反應，有促進炎癥發(fā)展的作用[14]，并分泌CX?CL9、CXCL10等趨化因子吸引BMSCs到達損傷部位[15]。在炎癥反應晚期，高水平的的促炎因子TNF-α、IFN-γ可刺激BMSCs向M2型轉化，抑制中性粒細胞的增殖、活化并阻止中性粒細胞遷移到損傷組織中，同時BMSCs可增強單核細胞和巨噬細胞中IL-10的產(chǎn)生[14,16]。國內(nèi)學者在探討TNF-α對小鼠BMSCs免疫抑制作用時發(fā)現(xiàn)，用25和50 ng/mL TNF-α干預BMSCs時，處理組上清液中的抑炎因子IL-10的表達和對照組相比并無明顯增加，而在100 ng/mL TNF-α刺激時，上清液中的IL-10含量較對照組明顯增加，與本實驗結果相符[17]。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，10 ng/mL TNF-α或100 ng/mL LPS處理BMSCs時，BMSCs上清液中的IL-6含量大幅度升高[18]。諸多研究表明炎性環(huán)境中IL-6的變化不僅和免疫炎癥有關，其表達水平的高低可能與TNF-α逆轉BMSCs的促炎表型相關[19-20]。

我們用 10～1000 ng/mL TNF-α 處理 BMSCs，從細胞上清IL-6的分泌量增加來看，經(jīng)TNF-α刺激后的BMSCs已發(fā)生M1極化，TNF-α濃度進一步增加后IL-10表達水平增加，提示BMSCs可進一步發(fā)生M2極化偏移，M1型和M2型BMSCs的極化代表了細胞一個廣泛的連續(xù)的功能狀態(tài)。關于TNF-α是通過何種途徑激活BMSCs的表型轉化的，有文獻報道M1向M2的轉化取決于MSC表面的TLR，極化到M1的狀態(tài)受TLR3的影響,而M2狀態(tài)受TLR4的影響[13-14]，低濃度促炎環(huán)境下，BMSCs表面的TLR3被激活，進一步促進MAPK激酶磷酸化，活化NF-κB，誘導IL-1β、IL-6的表達；NF-κB的激活可介導釋放更多的促炎因子，激活BMSCs表面的TLR4，同時介導釋放IL-10、IL-12等抗炎因子[21-22]。BMSCs對炎性因子的記憶作用使得越來越多的研究集中于干細胞的預處理，近年來，病毒轉染、缺氧休克、高密度脂蛋白、脂多糖、TNF-α等在BMSCs的瞬時處理方面取得很大進展[18,21]。預處理可增強細胞存活，促使細胞遷移到靶器官，顯著改善細胞在組織修復中的作用。但本該實驗也存在不足，移植后BMSCs的生存微環(huán)境比體外情況下模擬的炎性環(huán)境復雜得多，并且BMSCs在不同的炎性環(huán)境下發(fā)生極化的方向也有可能不同，實驗利用不同濃度的TNF-α來模擬炎性環(huán)境仍須改善。另外，用TNF-α預處理BMSCs后，移植到體內(nèi)的BMSCs對疾病的有效性有待研究。

綜上所述，TNF-α作為一種安全、簡便、可靠、準確的預處理方式，可提高BMSCs的生物學功能及分泌炎性因子的能力，較高濃度的TNF-α可逆轉BMSCs的促炎表型，促使BMSCs分泌更多的抑炎因子，進而更好地發(fā)揮治療作用。目前針對BMSCs干預措施的研究仍在進行中，需要進一步明確BMSCs發(fā)揮治療作用的機制及影響這一機制的炎性環(huán)境，這可優(yōu)化BMSCs的治療作用，為臨床應用提供理論依據(jù)。

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Effects of TNF-α on Biological Properties in Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

DU Chun-Yan1,ZHANG Huan1,YANG Jing2,WANG Xiao-Chen2,FENG Ze-Guo2*,GUO Quan-Yi3
1.Department of Anesthesiology,Beijing Tsinghua Changgung Hospital Tsinghua University,Beijing 102218;2.An?esthesia and Operation Center,General Hospital of PLA,Beijing 100853;3.Beijing Key Lab of Regenerative Medi?cine in Orthopaedics,Key Lab of Musculoskeletal Trauma&War Injuries,PLA,Beijing 100853;China

Objective:To investigate the effects of different concentrations of tumor necrosis factor-α（TNF-α）on the release of interleukin-6（IL-6） and interleukin-10（IL-10） from rat bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）.Methods:BMSCs were isolated and cultivated by whole bone marrow adherent culture method.Morpho?logical changes of BMSCs were observed by inverted phase contrast microscope,the surface markers of BMSCs were detected by flow cytometry.The BMSCs were treated with 10,100 and 1000 ng/mL TNF-α complete culturemedium respectively,the control group containing medium only,24 hours later,IL-6 and IL-10 in the cell cul?ture supernatants were detected by ELISA kit.Then the cells were treated with trypsin to detect the cell viability with PrestoBlue method.Results:The levels of IL-6 and IL-10 in the supernatants of TNF-α treated group were significantly higher than those in the control group（P＜0.05）.And IL-10（170.2±11.9 pg/mL） was the highest in 1000 ng/mL TNF-α intervention group,IL-6（144.0±18.6 pg/mL） was the highest in 100 ng/mL TNF-α interven?tion group,the difference was statistically significant among groups（P＜0.05）.PrestoBlue test showed that the fluo?rescence values of 10,100 and 1000 ng/mL TNF-α groups were all higher than those of the control group but there was no significant difference in fluorescence between groups（P＞0.05）.Conclusion:TNF-α may influence the proliferation of BMSCs and the secretion of IL-6 and IL-10.With the increase of TNF-α concentration,the BMSCs can increase the level of proinflammatory cytokine IL-6 and decrease anti-inflammatory cytokine IL-10.

bone marrow mesenchymal stem cells;proinflammatory cytokines;anti-inflammatory cytokines;tu?mor necrosis factor α

R329.28

A

1009-0002（2017）05-0584-06

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:beijing_301@sina.com

2017-03-01

杜春彥（1991- ），女，碩士研究生，（E-mail）duchunyan1991@163.com

馮澤國，（E-mail）beijing_301@sina.com